嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)是重要的工业菌株,广泛应用于酸奶和奶酪的发酵生产,是乳品工业中仅次于乳酸乳球菌的第二大发酵剂菌株,年消费量达到1021菌体细胞。近年来,研究发现S.thermophilus具有诸多的益生功能,例如嗜热链球菌能产生乳糖酶,分解酸奶中的乳糖,缓解乳糖不耐症。2010年欧洲食品安全局颁布了嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌发酵的酸奶具有益生功能的公告。因此,有关S.thermophilus在胃肠道内的存活、肠道屏障功能的提升以及抑制病原菌的黏附和入侵等方面开展大量研究。其中,S.thermophilus抗氧化活性成为研究焦点。研究发现,S.thermophilus细胞内存在多种与抗氧化有关的酶系和活性化合物,研究比较清楚的是超氧化物歧化酶(SOD),它能够将超氧阴离子(O2-)转化为氧分子和过氧化氢,进而保护菌株抵抗氧压力。最近在其基因组上又鉴定出一种新的过氧化物酶基因efeB以及谷胱甘肽合成酶基因gshF,并且发现这两个基因能够提高菌株在过氧化氢下的存活性,预示这两种酶具有清除细胞内活性氧(ROS)以及抗氧胁迫的作用。然而,S.thermophilus进入机体内是否具有抗氧化活性从而发挥益生作用的报道还很有限。本文以S.hermophilus CGMCC 7.179为主要实验材料,以肠道上皮细胞HT-29为模型,体内外分析该菌株及其产生的过氧化物酶EfeB和谷胱甘肽对细胞的抗氧化活性和抗炎作用,并探讨全局调控因子CodY对S.thermophilus ST2017应对氧胁迫的调控机制,取得实验结果如下:1.嗜热链球菌抗氧化特性的体外评价嗜热链球菌应用于酸奶发酵具有悠久历史,是公认的食品安全性菌株。为了评价该菌株的抗氧化活力,选育品质优良的发酵剂菌株,本文对分离自新疆、内蒙等传统发酵乳中的42株嗜热链球菌进行了抗氧化活性体外评价。结果显示,所试菌株均表现出一定的抑制抗坏血酸自氧化活性和DPPH自由基清除能力,以及较强的O2-清除能力和SOD活性,预示嗜热链球菌具有一定的抗氧化活性。此外,通过离散性分析发现,上述每一组抗氧化活性指标均有较大跨度的分布,表明嗜热链球菌的抗氧化能力具有菌株特异性。根据以上测定结果,选取4株高抗氧化活性及3株低抗氧化活性的菌株,测定它们对脂质过氧化的抑制活性,结果发现两株高抗氧化活性菌株SDMCC050231和SDMCC050242同样表现出较强的脂质过氧化抑制活性,并高于测试的其他4株乳酸杆菌(发酵乳杆菌、布氏乳杆菌、保加利亚乳杆菌以及鼠李糖乳杆菌)。通过以上抗氧化活性指标的检测及分析,证明了嗜热链球菌具有抗氧化能力,并筛选到2株具有较高抗氧化活性的菌株,为后续抗氧化研究奠定基础。2.S.thermophilus CGMCC 7.179对HT-29细胞氧化应激的保护作用嗜热链球菌细胞能够合成多种与抗氧化有关的酶及化合物,例如SOD和谷胱甘肽等。研究发现,S.thermophilus CGMCC 7.179(即S.thermophilusSDMCC050242)合成一种新型染料过氧化物酶EfeB,可协同参与该菌株的抗氧胁迫,并保护细胞在有氧条件下的正常生长。本文研究表明,S.thermophil CGMCC7.179与肠道上皮细胞HT-29共培养后,由过氧化氢诱导的胞内ROS含量降低了 20%,说明S.thermophilus CGMCC 7.179有效缓解了细胞内的氧化压力。同时在过氧化氢诱导下,S.thermophilus CGMCC7.179还能刺激HT-29细胞内三种主要抗氧化酶(SOD、GSH-px、CAT)活性的提升,分别为efeB缺失株与HT-29细胞共培养时的1.4倍、1.5倍、3倍,说明过氧化物酶EfeB参与了S.thermophilus CGMCC 7.179对HT-29细胞的抗氧化作用。Nrf2是调节细胞抗氧化通路的关键因子,Nrf2-ARE途径是细胞内最主要的抗氧化机制之一。为了研究S.thermophilus CGMCC7.179赋予细胞的抗氧化作用,利用蛋白免疫印迹法,检测了与S.thermophilusCGMCC 7.179共培养后,HT-29细胞内Nrf2蛋白的表达量,结果发现,共培养的HT-29细胞较正常培养细胞内Nrf2蛋白含量提高了 1.4倍。RT-qPCR检测Nrf2相关的抗氧化酶基因HO-1、CGLC、NQO1以及TXNRD1的转录水平发现,与菌株CGMCC7.179共培养后的HT-29细胞内这四种基因的转录水平较正常细胞显著上升,由此证实S.thermophilusCGMCC 7.179通过激活细胞内Nrf2蛋白表达及其下游抗氧化酶基因的转录来应对活性氧的损伤,而efeB缺失株与HT-29细胞共培养后,Nrf2蛋白及其相关抗氧化酶基因的转录表达均未有明显的提升,说明过氧化物酶EfeB在S.thermophilus CGMCC 7.179调控宿主细胞的抗氧化机制中发挥重要作用。以上实验结果表明,S.thermophilus CGMCC7.179能够提高细胞的抗氧化活性并赋予宿主细胞抵御氧化压力的保护作用,并且这种作用机制与过氧化物酶EfeB有关。3.过氧化物酶EfeB对HT-29细胞的抗氧化作用过氧化物酶EfeB是目前乳酸菌中唯一存在利用Tat(双精氨酸转运)系统分泌的一种蛋白质。为了进一步分析S.thermophilus CGMCC 7.179赋予HT-29细胞抗氧化作用是由胞外分泌的EfeB所介导,本文首先将EfeB基因克隆至大肠杆菌进行了异源表达,并将不同浓度EfeB纯蛋白与HT-29细胞共孵育24小时,检测在5mM过氧化氢胁迫下细胞的存活率。结果显示,添加1-1.5 μg/mL浓度的EfeB蛋白即可保护HT-29细胞免受过氧化氢的伤害;当添加1μg/mLEfeB蛋白时,HT-29细胞内SOD活性比正常培养细胞提高了 3倍,并且发现EfeB蛋白能够促进HT-29细胞中Nrf2蛋白表达及HO-1基因转录水平的提高,分别比正常培养细胞提高了 1.2和1.6倍,说明EfeB蛋白对细胞的抗氧化作用与Nrf2-ARE途径的激活有关。为了进一步证明胞外分泌的EfeB蛋白的抗氧化作用,同时添加EfeB蛋白和efeB突变株与HT-29细胞共培养后,胞内SOD活性较正常培养细胞提升2倍,Nrf2蛋白含量和基因转录水平分别上升了 1.6和3.6倍,HO-1基因的转录水平也上升了 5.7倍。外源回补了 EfeB蛋白的efeB突变株对细胞的抗氧化作用恢复或超过了野生菌株的效果,由此证明了胞外分泌的EfeB赋予S.hermophilus CGMCC 7.179对细胞的抗氧化作用。以上结果证明了S.thermophilus CGMCC 7.179的过氧化物酶EfeB具有胞外抗氧化活性,在一定浓度下能够激活Nrf2-ARE途径并保护细胞抵御氧化压力,同时赋予嗜热链球菌有效的抗氧化活性。4.谷胱甘肽生物合成对S.thermophilus CGMCC 7.179抗炎作用的研究谷胱甘肽是一种广泛存在于生物体内的重要生物活性化合物,具有抗氧化、抗炎以及解毒等功效。嗜热链球菌细胞中编码一种双功能谷胱甘肽合成酶(GshF),催化谷胱甘肽的一步合成,本文对嗜热链球菌合成的谷胱甘肽的抗氧化活性进行了分析。首先通过同源臂单交换的方法插入失活S.thermophilus.CGMCC 7.179基因组中的gshF基因,构建得到的gshF突变株对氧压力敏感,并且测定该突变株中的谷胱甘肽合成量显著低于野生株CGMCC7.179。随后将gshF突变株、菌株CGMCC7.179分别与HT-29细胞共培养,并测定细胞在过氧化氢刺激下的存活率,结果发现,相比菌株CGMCC7.179,与gshF突变株共培养后细胞的存活率显著降低,表明HT-29细胞对氧化压力的耐受性与GshF催化的谷胱甘肽生物合成有关。此外,gshF突变株调节HT-29细胞内抗氧化酶活性以及Nrf2相关基因转录水平的降低,证明了 GshF催化的谷胱甘肽生物合成对嗜热链球菌具有重要的生理作用。为了检测谷胱甘肽赋予菌株的抗炎症效果,分别将菌株CGMCC7.179、gshF突变株与沙门氏菌共同孵育HT-29细胞,酶联免疫法分析表明,S.thermophilus CGMCC7.179能够减弱沙门氏菌感染引发的细胞因子IL-8升高;同时,抑制炎症因子CXCL1和CCL20的转录水平,证明S.thermophilus CGMCC 7.179具有显著的抗炎活性。相比菌株CGMCC 7.179,gsh 突变株显著上调了 IL-8的分泌以及CXCL1和CCL20的转录水平,证明谷胱甘肽对嗜热链球菌抗炎活性的重要作用。以上实验结果表明,GshF催化的谷胱甘肽生物合成能够促进S.thermophilus CGMCC 7.179对人体肠道上皮细胞的抗炎作用,是嗜热链球菌益生特性的重要体现。5.全局调控因子CodY对S.thermophilusST2017氧压力响应的调控机制CodY是一个调控嗜热链球菌细胞代谢网络的全局转录调控因子,参与细胞内多种生理代谢活动。转录组分析,CodY缺失条件下,环境响应因子CovR转录水平提高,菌株存活性降低,预示着CodY参与了S.thermophilus ST2017抗氧胁迫作用。本文研究了 CodY对S.thermophilusST2017氧压力响应的调控机制。通过转录组和RT-qPCR分析,在codY缺失突变株中,谷胱甘肽合成酶基因(gshF)的转录下调了 3倍;在mCDM培养基中,谷胱甘肽合成量较野生株下降20%,而在过氧化氢处理后细胞的存活率也下降了 50%,说明CodY通过调控谷胱甘肽的生物合成来响应环境中的氧压力。体外凝胶阻滞实验显示,CodY纯蛋白能够与gshF上游的启动子区结合,证明了 CodY对gshF的直接调控作用。以上实验结果证明,在S.thermophilus ST2017中CodY能够通过直接调控gshF的转录来响应环境中的氧压力。此外,通过转录组发现CodY对二组分系统CovRS也有调控作用,RT-qPCR也证实了该结论。实验结果显示,covR缺失突变株对环境中的氧气敏感,表明CovR的调控也具有抗氧胁迫作用。然而,covR突变株在过氧化氢刺激下的存活率在30分钟时升高,而在1小时后直接降低至0,说明CovR对S.thermophilus ST2017氧压力响应的调控不只是单纯的促进作用。通过对covR缺失株的转录组分析,发现CovR能够启动S.thermophilus ST2017中谷氧还蛋白亚基的转录表达,因此推测CovR通过调控谷氧还蛋白的合成来维持菌株的氧化还原平衡。以上结果表明,CodY对嗜热链球菌氧压力响应的调控通过两种方式:一是通过直接调控GshF催化的谷胱甘肽合成途径;二是通过CovR间接调控谷氧还蛋白及其他调控因子的转录表达。