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重楼具有重要的药用和经济价值,其根茎已成为宫血宁胶囊、云南白药创可贴、云南白药喷雾剂、清热止咳颗粒、抗病毒颗粒等多种中成药和新药的主要原材料。然而,重楼的个体发育过程十分缓慢,从种子发芽到药用,一般需要5年以上的时间,导致市场供不应求,造成了重楼野生资源的快速萎缩。野生资源的匮乏催生了重楼的家种模式,主要有块茎无性繁殖和种子育苗有性繁殖等两种方式。但因种子育苗繁殖方式周期长、风险大,目前家种重楼仍主要靠块茎无性繁殖,造成了商品量的相对浪费。 另外,按最新版的药典规定,正品重楼为百合科植物云南重楼(P.polyphylla var.yunnanensis)和七叶一枝花(P.polyphylla var.chinensis)的干燥根茎。但截止目前,发现的重楼种属已多达二十多种,故挖掘具有药用潜力的重楼属可入药植物资源,同时通过植物组培提高繁殖率,对解决重楼产能低下,缓解重楼资源压力有极其重要的意义。 本文为维持重楼的可持续利用,主要从两个方面进行研究:(1)优异资源的收集和评价:采集四川盆周山区野生重楼资源,根据引种表现初步筛选后,利用DNA条形码—核ITS和叶绿体matK基因序列进行分子系统发育地位分析,并测定其药效活性成分皂苷的含量,以期获得具有药用潜力的优异地方资源;(2)重楼快繁体系的建立:初步探究种皮、温度、激素等因素对重楼种子休眠的影响,建立重楼种子快速萌发体系,打破其休眠,缩短萌发周期,并利用无菌萌发的幼苗诱导愈伤组织,以期获得组织培养的完整植株,为工业化生产提供材料和技术支持。具体研究结果如下: (1)在四川盆周山地收集21份地方资源,引种至成都平原后初步筛选获得5个生长势较好的资源。结合形态学和分子系统学鉴定结果,它们分别为滇重楼GK1、GK2和GQ1,华重楼GQ2,及长柱重楼MH1。 (2)基于HPLC技术进行的皂苷成分分析结果表明,GK1、GK2、GQ1、GQ2、MH1和对照滇重楼(CK)的重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ、Ⅶ的含量及其比例表现各异,其中总含量表现为GQ2>MH1>GQ1>CK>GK2>GK1。重楼皂苷Ⅰ在GQ2和MH1中占比较高,分别较CK高出67.61%和73.25%,而重楼皂苷Ⅶ在GK2中占比最高,表现为56.38%,重楼皂苷Ⅵ在GQ1中含量最高。其中长柱重楼MH1的重楼皂苷Ⅰ及重楼皂苷总含量均较高,为筛选滇重楼、华重楼的替代药材提供了新选择。 (3)重楼种皮提取液成分的代谢组学分析结果表明,种皮中含量占比高于5%的物质有六大类,分别是皂苷类、甘油类、芳香族化合物(酚类物质)类、甘油磷脂类、异戊烯醇脂类、以及激素类,其中皂苷类物质占比最高,达到34%。这些化感物质可能是阻碍种子萌发的重要因素之一。 (4)建立了重楼快速萌发体系。重楼种子在经过去种皮,40℃水浴,2%双氧水4℃浸泡,KNO3+GA320℃浸泡,再次2%双氧水4℃浸泡,KNO3+GA320℃浸泡,系列处理后,萌发时间缩短至2-3个月,萌发率可达约90.00%。 (5)重楼种子内源激素的含量可能对种子休眠及萌发具有重要影响。重楼种子萌发时ABA含量降低,同时IAA、GA、ZR的含量升高。 (6)优化了重楼“生根壮苗”培养基。采用MS、WPM作为基础培养基,附加不同浓度的激素配比,结果显示以WPM作为基本培养基附加0.3mg/L6-BA+0.4mg/L NAA,最有利于萌发后的重楼成苗,成苗诱导率为91.67%,苗颜色深绿,30d苗平均高26.23mm,根均长16.27mm。 (7)重楼愈伤组织的培养研究结果表明,分生能力越强的部位越可能获得愈伤组织,以无菌重楼幼苗的上下胚轴的诱导成功率最高,而叶、根和茎杆很难启动诱导愈伤。启动诱导愈伤的最适培养基为:MS+0.1mg/L6-BA+3mg/L2,4-D。