论文部分内容阅读
目的：通过实时荧光定量PCR检测小鼠外周血线粒体DNA(mtDNA)的缺失突变,从分子水平揭示以补肾健脾、养血活血法为组方原则的康欣口服液延缓衰老的机理,为临床应用康欣口服液延缓衰老提供实验依据。方法：从老年小鼠外周血DNA分别扩增代表mtDNA缺失突变的267bp片段及代表野生型mtDNA的470bp片段,并将其克隆至pGEM-T Easy载体以构建重组质粒pGEM-T Easy/267和pGEM-T Easy/470,以重组质粒为标准品通过10-2-10-5倍比系列稀释,建立实时荧光定量PCR标准曲线,用以检测小鼠外周血mtDNA缺失突变。用实时荧光定量PCR方法分别检测近交系Balb/c青年小鼠(6-8周龄)、中年小鼠(6-8月龄)、老年小鼠(14月龄)外周血mtDNA的缺失突变；选用自然衰老的近交系Balb/c老年小鼠,分为老年空白对照组(灌胃给予生理盐水)和老年康欣口服液组(灌胃给予康欣口服液)。四个月后,采用实时荧光定量PCR的方法,检测两组小鼠外周血mtDNA缺失突变。结果：从老年小鼠外周血DNA分别扩增出了代表mtDNA缺失突变的267bp片段及代表野生型mtDNA的470bp片段,并将其克隆至pGEM-T Easy载体,得到了重组质粒pGEM-T Easy/267和pGEM-T Easy/470,以重组质粒为标准品建立了实时荧光定量PCR标准曲线(相关系数>0.994)。老年Balb/c小鼠外周血mtDNA缺失突变明显,而在中年小鼠与青年小鼠外周血mtDNA中未检测到相同片段的缺失；与老年空白对照组比较,康欣口服液能显著降低老年Balb/c小鼠mtDNA的缺失突变(P<0.05)。结论：1.实时荧光定量PCR方法是一种检测小鼠外周血线粒体缺失突变的有效方法,该方法敏感性好,特异性高。2.外周血mtDNA的缺失随年龄增长而积累,在老年小鼠的外周血mtDNA中可以检测到4236bp缺失突变。3.喂服康欣口服液能够降低老年小鼠外周血mtDNA缺失突变,提示补肾健脾、养血活血法方药能减少mtDNA的氧化损伤,对mtDNA有保护作用。