第一部分大鼠肺发育过程中FAK表达变化【目的】研究大鼠肺发育不同阶段粘着斑激酶（focal adhesion kinase，FAK）表达变化，探讨FAK在肺发育过程中可能发挥的作用。【方法】于大鼠肺发育不同阶段（胚胎18、20和21d及出生后1、4、7、10和21d）留取大鼠肺组织标本，采用免疫组织化学法和Western blot技术对FAK蛋白表达进行定位、定量检测，采用RT-PCR方法对FAK mRNA表达水平进行半定量分析。【结果】在肺发育不同时期，从蛋白、mRNA水平均证实有FAK表达，其表达部位主要分布于上皮细胞、血管内皮细胞和间质细胞；胎龄18d表达较弱，胎龄20d和21d表达处于较高水平；生后1d有所下降，4d达高峰，以后呈逐渐下降趋势。【结论】FAK在肺发育过程中发挥重要作用，它可能与气道上皮发育、呼吸管腔和毛细血管网形成密切相关，并参与肺泡上皮细胞增殖、分化。第二部分85％高氧对早产大鼠肺组织FAK表达的影响【目的】建立高氧肺损伤动物模型，研究持续高氧暴露对新生大鼠肺组织中FAK表达的影响，探讨FAK表达变化在新生大鼠高氧肺损伤发生、发展中可能的作用。【方法】剖宫术取出孕21d大鼠作为早产鼠，将早产鼠置于85％高氧环境下4d、7d和14d，各组均以空气组早产鼠为对照，留取肺组织标本，采用免疫组织化学法和Western blot技术对肺组织FAK和磷酸化FAK(FAK-Tyr³⁹⁷)表达进行定位、定量检测，采用RT-PCR方法对肺组织FAK mRNA表达水平进行半定量分析。【结果】FAK蛋白、FAK-Tyr³⁹⁷蛋白和FAK mRNA在空气组早产大鼠肺组织均有较高水平表达，高氧暴露4d、7d和14d，FAK mRNA和FAK-Tyr³⁹⁷蛋白表达水平均呈不同程度的下降，尤以高氧14d最明显。【结论】持续高氧暴露导致早产鼠FAK异常表达，参与了高氧肺损伤的发生和发展；FAK表达受抑制是导致正常肺泡化过程受阻以及不成熟肺组织损伤后异常修复的重要因素，其机制有可能与其抑制肺泡上皮细胞增殖、分化，以及毛细血管形成有关。第三部分FAK活化与高氧暴露下肺泡Ⅱ型细胞增殖、凋亡的关系探讨【目的】建立高氧细胞模型，研究高氧暴露对体外培养的胎鼠肺泡Ⅱ型细胞（AECⅡ）FAK表达的影响，并进一步探讨FAK活化与高氧暴露下AECⅡ增殖、凋亡的相关性。【方法】分离、培养19d～20d胎鼠AECⅡ，经贴壁纯化后随机分为空气组（Ⅰ）、高氧组（Ⅱ），Ⅱ组在更换培养液后通入5L／min 95％O₂-5％CO₂高纯混合气，10min后密封。各组均置于培养箱（37℃，5％CO₂）中，培养6h、12h、24h和48h后，收获各组细胞，提取细胞总RNA和总蛋白，RT-PCR和Western-blot半定量分析各组培养细胞FAK mRNA及FAK蛋白、FAK-Tyr³⁹⁷蛋白表达强度，并利用Annexin-V和PI双标法经流式细胞仪检测高氧暴露下AECⅡ发生凋亡的时空变化。选择高氧12h为研究点，将贴壁纯化后AECⅡ随机分为4组：①空气组②高氧组③空气+Matrigel组④高氧+Matrigel组，⑧和④组在AECⅡ分离纯化后接种在Matrigel包被的培养瓶或培养板上，提取细胞总RNA和总蛋白，RT-PCR和Western blot半定量分析人工重组基底膜Matrigel胶对FAK蛋白、FAK-Tyr³⁹⁷蛋白和FAK mRNA表达的影响，以了解Matrigel胶对FAK活性的调节作用。为了解高氧暴露下AECⅡ增殖、凋亡与FAK活化、阻断的相关性，将分离纯化后AECⅡ随机分为6组：①空气组②高氧组③空气+Matrigel组④高氧+Matrigel组⑤空气+Matrigel+（RGD+YIGSR）组⑥高氧+Matrigel+（RGD+YIGSR）组，FAK阻断剂RGD和YIGSR浓度为50ug／ml，用PCNA免疫细胞化学法和TUNEL法分别检测FAK阻断和激活状态下AECⅡ增殖和凋亡状况。【结果】培养6h时，高氧组AECⅡFAK蛋白表达水平有所下降，但与空气对照组比较没有统计学差异（p＞0.05），高氧暴露12h时，高氧组AECⅡ细胞表达FAK蛋白水平明显下降，与空气对照组比较有显著差异（p＜0.05），高氧暴露24h和48h时，FAK蛋白下降趋势更加明显（p＜0.01）；与空气对照组比较，高氧暴露6h，AECⅡ细胞表达FAK-Tyr³⁹⁷水平就显著下降（p＜0.05），随高氧暴露时间延长，FAK-Tyr³⁹⁷下降趋势更加显著（p＜0.01）；对FAK mRNA检测得到类似结论；流式细胞仪检测AECⅡ凋亡发现，高氧暴露12h，Annexin-V⁺／PI^-（早期凋亡）亚群细胞所占比例最高，随高氧暴露时间延长，Annexin-V⁺／PI^-亚群细胞所占比例逐步减低。与空气组比较，接种于Matrigel胶后，AECⅡFAK mRNA和FAK蛋白、FAK-Tyr³⁹⁷蛋白表达水平均明显增加，说明Matrigel胶具有促进FAK表达和活化作用。与空气组比较，高氧暴露12h时，AECⅡPCNA表达强度明显下降（p＜0.05），TUNEL标记细胞明显增多（p＜0.01）；空气+Matrigel组凋亡指数无显著差异，而PCNA表达强度明显增强（p＜0.01）。与高氧组比较，高氧+Matrigel组AECⅡPCNA表达明显增高（p＜0.05），凋亡指数明显下降（p＜0.05）。与“空气+Matrigel组”比较，“空气+Matrigel+（RGD+YIGSR）”组AECⅡPCNA表达强度均明显下降（p＜0.01），凋亡指数均明显增加（p＜0.01）；同样，与“高氧+Matrigel组”组比较，“高氧+Matrigel+（RGD+YIGSR）”组AECⅡPCNA表达强度也明显下降（p＜0.01），凋亡指数明显增高（p＜0.01）。【结论】①高浓度氧诱导AECⅡ凋亡和坏死，抑制AECⅡFAK的表达，FAK表达抑制是AECⅡ凋亡和坏死的重要原因之一。②Matrigel胶具有抑制AECⅡ凋亡、促进AECⅡ增殖作用，对高氧暴露下AECⅡ有保护作用，且与其促进FAK表达和活化有关。第四部分FAK活化抑制高氧暴露下AECⅡ凋亡、促进其增殖的信号转导机制【目的】研究高氧暴露下AECⅡPI-3K（磷脂酰肌醇3—激酶）、Akt（丝氨酸／苏氨酸激酶）、磷酸化Akt(p-Akt Ser⁴⁷³)、GSK3（糖原合成酶3）和磷酸化Bad(p-Bad Ser¹³⁶)表达变化，探讨FAK活化促进AECⅡ增殖、抑制AECⅡ凋亡信号转导机制。【方法】将贴壁纯化后AECⅡ随机分为4组：①空气+Matrigel胶；②高氧+Matrigel胶；③空气+Matrigel胶+（RGD+YIGSR）组；④高氧+Matrigel胶+（RGD+YIGSR）组。培养12h后收集各组细胞，提取总蛋白，Western blot半定量分析各组培养细胞PI-3K蛋白表达强度。为检测PI-3K下游分子，增设⑤空气+Matrigel胶+LY294002；⑥高氧+Matrigel胶+LY294002，PI-3K阻断剂LY294002浓度为25umol／L，Western blot半定量分析各组培养细胞Akt和p-AktSer⁴⁷³蛋白表达强度。Akt下游分子GSK3和p-Bad Ser¹³⁶表达强度均采用流式细胞仪进行检测。【结果】与①组比较，②组PI-3K表达强度明显降低（p＜0.05），③组下降更加明显（p＜0.01）；与②组比较，④组PI-3K表达强度明显降低（p＜0.05），证实PI-3K是FAK作用的下游分子。与①组比较，⑤组Akt表达强度有所下降，但没有统计学差异（p＞0.05），而p-Akt Ser⁴⁷³表达强度明显下降（p＜0.01）；与②组比较，⑥组Akt表达强度未见明显下降，p-Akt Ser⁴⁷³表达强度明显下降（p＜0.01）。与①组比较，③组AECⅡ不仅p-Akt Ser⁴⁷³表达强度明显下降（p＜0.01），Akt表达强度也明显下降（p＜0.01）；与②组比较，④组p-Akt Ser⁴⁷³和Akt均明显下降（p＜0.01）。表明Akt不仅是PI-3K下游分子，也是FAK下游分子，高氧暴露下AECⅡ增殖和凋亡状况受FAK—PI-3k／Akt信号通路调节。与①组比较，②组p-Bad Ser¹³⁶表达强度明显降低、GSK3表达强度明显增高（p＜0.05），③组p-Bad Ser¹³⁶表达强度显著降低（p＜0.01），而GSK3表达强度显著增高（p＜0.01），同样，⑤组p-Bad Ser¹³⁶表达强度也显著降低（p＜0.01），GSK3表达强度显著增高（p＜0.01）；分别与②组比较，④和⑥组p-Bad Ser¹³⁶表达强度均显著降低、GSK3表达强度均显著增高（p＜0.01）。结果表明，阻断FAK的表达同样使Akt下游分子Bad磷酸化(p-Bad Ser¹³⁶)水平降低、GSK3表达水平增高，与PI-3K阻断剂LY294002作用的结果一致，说明Bad和GSK3同样是FAK信号转导通路下游分子。【结论】（1）FAK—PI-3K／Akt信号通路参与高氧暴露下AECⅡ凋亡和增殖的调控，Matrigel胶活化FAK后，可通过PI-3K／Akt途径促进Bad磷酸化、抑制GSK3表达而发挥抗凋亡作用；（2）高浓度氧一方面通过抑制AECⅡFAK表达，抑制FAK—PI-3K／Akt信号通路，促进AECⅡ凋亡，另一方面也可直接抑制AECⅡPI-3K、p-Akt Ser⁴⁷³和p-Bad Ser¹³⁶表达，上调GSK3表达，，加剧AECⅡ凋亡的发生。