水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.Oryzae,简称Xoo）是一种革兰氏阴性病原细菌,能侵染水稻引起白叶枯病（bacterial blight,BB）,在生产上造成水稻严重损失。在开放的自然界中,植物持续不断地遭受病原菌的入侵,只有极少数能够成功对植物造成病害,然而植物却不像动物那样具有免疫细胞,但在长期与病原菌斗争的过程中,植物同样进化出精细的调控机制来识别进入宿主的异物并快速激发防卫反应来抵御病原物的入侵。植物先天免疫在感受到病原菌来源的分子后被激活来抵御其进一步入侵扩散,在漫长的过程中,植物进化出两道先天免疫防线,植物初级免疫反应（PTI）和效应因子触发的免疫反应（ETI）。本课题组以水稻黄单胞菌白叶枯致病变种PXO99A为研究对象,前期工作通过全基因组扫描,筛选找到39个有潜力的致病因子,克隆到植物双元载体并转化构建重组根癌农杆菌。本研究主要对这些潜在致病因子更进一步筛选,并对有活性致病因子的功能及特性进行系统性深入研究,获得如下结果:1)生物信息学预测的致病因子对烟草过敏反应的筛选:烟草瞬时表达筛选获得一个能引起烟草产生坏疽的蛋白,在此研究中命名为TAP;同时获得了8个稳定抑制INF1（一个来自卵菌疫霉,能激发烟草产生坏疽的蛋白）的蛋白,分别命名为SIH1～8。2)TAP蛋白的功能研究:烟草瞬时表达TAP蛋白可以引起其叶片产生坏疽,进一步通过台盼蓝染色及电解质渗漏实验,确定了TAP蛋白是通过诱发烟草细胞死亡,从而在叶片上产生坏死斑。深入的Tunel实验（核染色）初步推测此坏死斑是由于烟草细胞凋亡导致的。通过一系列实验,我们发现TAP蛋白可以激发植物的初级免疫反应（PTI）,如活性氧的产生和胼胝质的沉积,并且对与初级免疫相关的免疫基因的表达也有一定程度的影响。对TAP蛋白的生物信息学分析发现,此蛋白在黄单胞菌中高度保守,该蛋白含有一个与BI-1家族同源的保守结构域及7个跨膜螺旋,通过烟草瞬时表达分段截短的TAP蛋白,找到了最小引起烟草细胞死亡的功能区域,其区域位于羧基端150～253 aa,并含完整的BI-1结构域。烟草瞬时表达TAP蛋白后,分别在8、12、36、72和96小时,抽取烟草叶片细胞总RNA,实时荧光定量PCR发现,此蛋白在36小时之前会引起烟草某些初级免疫通路上免疫基因的下调,72、96小时后导致这些免疫基因的上调。将TAP蛋白与e GFP融合,烟草瞬时表达后荧光显微观察发现,TAP蛋白定位在烟草细胞膜上。我们通过在出发菌PXO99A中同框缺失TAP蛋白及超表达TAP蛋白,发现TAP蛋白的存在会影响菌体的生长速率,限制胞外多糖的产生、爬动性能力的下降和增强对过氧化氢的敏感性。进一步的致病性实验显示,在PXO99A中超表达TAP蛋白会导致致病性的急剧下降,而基因缺失突变株与野生型的致病性差异不明显,实时荧光定量PCR结果显示,TAP蛋白在水稻模拟培养基中表达被抑制。利用酵母双杂交技术,在水稻c DNA文库中筛选到与TAP蛋白发生相互作用的蛋白Os BP-73,已有报道Os BP-73蛋白与细胞增殖调控相关。根据以上的结果,我们初步推测了TAP蛋白的作用机制:TAP蛋白早期可能是一个通过抑制植物免疫基因帮助病原菌定殖的致病因子,随着病原菌与植物长期的进化共存,植物可能通过膜上的一个未知PRRs受体,识别TAP蛋白启动下游免疫基因的表达,最终通过细胞死亡限制病原菌的生长,另一方面,病原菌也通过抑制TAP基因的表达来逃脱宿主的免疫。我们的研究为病原菌和宿主共进化提供了一个实例,TAP蛋白可以作为一个潜在的抗病基因用于宿主抵抗病原菌的侵染。3)SIH蛋白的功能研究:效应蛋白在黄单胞菌侵染植物的过程中起着重要作用,通过抑制植物初级免疫使细菌在植物中更好定殖,检测抑制PAMPs引起免疫表型是筛选效应蛋白通用方法。对预测致病因子进行筛选分析发现,8个SIH蛋白可以抑制疫霉激发子INF1触发的HR,同时SIH1、SIH4、SIH7、SIH8可以较强抑制由Bax介导的PCD,除SIH4外均可以抑制由TAP引起的细胞死亡,SIH4、SIH5、SIH7能够抑制由鞭毛蛋白flg22激发的活性氧产生,8个SIH蛋白对与初级免疫相关的免疫基因的表达也有不同程度的抑制或激发。通过同框缺失对预测致病因子敲除后进行水稻致病性检测,发现SIH4、SIH6和SIH8的缺失突变体对水稻的致病性减弱。将SIH蛋白与e GFP融合,烟草瞬时表达后荧光显微观察发现,SIH6和SIH8蛋白定位于烟草细胞质内,说明这两个预测致病因子是在细胞质发挥其致病功能。根据以上的结果,我们初步推测了SIH蛋白的作用机制:不同SIH蛋白可能在免疫防御反应的不同信号通路中起作用,可以抑制不同PAMPs引起的细胞死亡,说明它们在黄单胞菌侵染水稻的致病过程中起重要作用。