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第一部分:阿片类物质使用与HIV-1原发性耐药的横断面研究目的:调查未经抗病毒治疗的I型人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virustype I,HIV-1)感染者体内 HIV-1 原发性耐药流行现状,比较感染者中阿片类毒品滥用人群和非阿片类毒品滥用人群间HIV-1原发性耐药的差异,初步阐明阿片类毒品滥用与HIV-1耐药的关系。方法:在前期与南宁市红十字会医院、柳州市疾病预防控制中心、灵山县疾病预防控制中心合作建立的吸毒人群队列中,在2015年1月-12月期间,采用方便抽样纳入所有未经抗病毒治疗且符合标准的HIV-1感染者。按是否使用阿片类物质分为阿片类物质滥用HIV-1感染组(Opioid HIV+组)和非阿片类毒品滥用HIV-1感染组(Non-Opioid HIV+组)。收集研究对象人口学信息并采集外周静脉血5ml,提取病毒RNA,RT-PCR扩增pol区基因,测序获得序列后提交到斯坦福大学的HIV-1耐药数据库,比对获得样本中对非核苷类逆转录酶抑制剂(Non-nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(Protease inhibitors, Pls)、核苷类逆转录酶抑制剂(Nucleoside reverse transcriptase inhibitors,NRTIs)三类药物的耐药信息。采用卡方检验、确切概率法比较Opioid HIV+组和Non-Opioid HIV+组两组间人口学特征分布、原发耐药率、药物相关耐药率、药物相关耐药性突变位点分布的差异;采用spearman秩相关分析美沙酮维持治疗时长、剂量与HIV-1耐药的相关性。结果:(1)研究对象人口学特征共招募研究对象243例,其中Opioid HIV+组134例,Non-Opioid HIV+组109例;男性146例,女性97例;以汉族为主,平均年龄(45.5士 11.9)岁;各组间性别、民族、年龄等人口学特征差异均无统计学意义(χ2=0. 430,P=0.512; χ2=1.566,P=0.211; χ2=0.134,P=0.714)。(2)两组人群基因型耐药检测结果及比较RT-PCR共获得184例阳性扩增样本,其中Opioid HIV+组101例,Non-Opioid HIV+组83例;共发现26例耐药性样本,原发性耐药率为14.4%(26/184)。Opioid HIV+组检测到19例耐药性样本,原发耐药率为18.8%( 19/101);NNRTIs、Pis、NRTIs药物耐药性突变发生率分别为12.9%、5.9%、2.0%,双重耐药发生率为3.0%,双位点耐药发生率为4.0%;出现NNRTIs相关耐药突变分别是 E138A( 5.0%)、K103N(4.0%)、V179D(3.0%)、G190A( 1 .0%)、V106M(1.0%)、L100I( 1.0%),出现 Pis 相关耐药突变分别是 V82F(4.0%)、M46I(3.00%),出现NRTIs相关耐药突变是T215I/S(2.0%);对3种抗病毒药物的耐药性主要集中在中、低度耐药,高度耐药仅出现在NNRTIs的依非韦伦(EFV)和奈韦拉平(NVP)。Non-Opioid HIV+组检测到7例耐药性样品,原发耐药率为8.4%(7/83);NNRTIs、Pis药物耐药性突变发生率分别为4.8%、3.6%,无双重耐药、双位点耐药出现;没有发现NRTIs耐药突变;出现NNRTIs相关耐药突变分别是 E138A(3.6%)、K103N( 1.2%),出现 PIs 相关耐药突变是 V82F(3.6%);对3种抗逆病毒药物的耐药性主要集中在中、低度耐药,高度耐药出现在NNRTIs 的 EFV 和 NVP。经卡方检验分析,在Opioid HIV+和Non-Opioid HIV+两组间原发性耐药率差异有统计学意义(χ2=4.044, P=0.044); PIs和NNRTIs相关的原发耐药突变发生率在两组间差异无统计学意义(P>0.05); Pis相关耐药突变V82F、NNRTIs相关耐药突变E138A、K103N在两组间的差异无统计学意义(P>0.05); Opioid HIV+组中,美沙酮维持治疗服用时长、剂量与HIV-1耐药无相关性。结论:在广西未治疗HIV-1感染者中,阿片类毒品滥用者原发性耐药发生率高于非阿片类毒品滥用者,且NNRTIs、Pis、NRTIs三类抗病毒药物的耐药突变发生率均较高。阿片类毒品滥用与HIV-1耐药具有相关性。第二部分:表型耐药检测假病毒的构建目的:构建一种优化的假病毒耐药检测模型,为HIV-1表型耐药检测提供成本较低、简便易行的研究工具。方法:从质粒pSV-EGFP中扩增出EGFP基因,采用双酶切法将EGFP基因克隆至骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-,以此构建假病毒重组骨架质粒;采用RT-PCR方法从感染者HIV-1 RNA中获得包膜蛋白基因,采用双酶切法将EGFP基因克隆至真核表达质粒pcDNATM3.1(+),以此构建重组包膜质粒;单转染重组包膜质粒至293t细胞验证表达;共转染重组质粒至293t细胞获得假病毒;采用与TZM-b1细胞共培养法,通过荧光表达检测验证假病毒感染性。结果:(1) pNL4-3.EGFP.E-R-质粒的构建及验证经双酶切电泳及EGFP表达验证,外源性EGFP基因成功克隆至重组骨架质粒pNL4-3.Luc.E-R-中并能在293t细胞中表达,可用于假病毒的构建。(2) pcDNA3.1-env的构建及验证从HIV-1阳性血浆样本中获得8份env基因扩增产物,分别克隆到pcDNATM3.1(+),经双酶切电泳及Western blot实验验证,获得10个阳性克隆,可用于假病毒的构建。(3)重组假病毒产生及感染性验证将两种质粒,以质量比 2:1 (pcDNA3.1-env: pNL4-3.EGFP.E-R-)共转染293t细胞,48h后收集细胞上清获得假病毒。将假病毒加入到TZM-bl细胞共培养48h后,可以观察到荧光表达。结论:带有EGFP基因重组假病毒系统初步构建成功。