论文部分内容阅读
猪圆环病毒（Porcine circovirus,PCV）是一种无囊膜的单链负股环状DNA病毒，呈二十面体对称结构，病毒粒子直径为14~17nm，是目前发现的最小的动物病毒之一。1974年由德国学者Tischer等首次从猪肾传代细胞（PK-15）中分离到的，1982年被命名为猪圆环病毒。猪圆环病毒分为两个血清型：PCV1和PCV2。其中PCV2具有致病性，能引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），皮炎和肾病综合征（PDNS）等疾病，给养猪业造成严重的经济损失，目前该病毒已成为国内外研究的热点，但该病毒的致病机制目前尚未完全清楚。 猪圆环病毒2型主要有与病毒复制相关的Rep蛋白，与免疫原性相关的Cap蛋白及ORF3编码的与细胞凋亡相关的非结构蛋白三种蛋白。其中Rep蛋白是PCV2复制的催化成分，对于Rep蛋白的深入研究，将有助于了解PCV2病毒的复制和致病机理。糖基化作为一种主要的翻译后修饰对蛋白质功能有着重要影响，病毒蛋白的糖基化在病毒的生命周期中起着重要的作用。50％以上的蛋白质存在糖基化现象，其中Rep蛋白含有三个N-糖基化位点。 为了分析PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制的影响，本研究拟在前期实验室构建好的单拷贝PCV2感染性克隆的基础上，获得三个单点突变和一个未突变的双拷贝PCV2全长感染性克隆，分别命名为2M23、2M256、2M286、2PCV2，接种无污染的PK-15细胞，体外拯救突变体病毒。通过间接免疫荧光检测病毒的拯救效果，TCID50测定病毒的感染力，荧光定量PCR检测细胞病毒的载量。结果显示，PCV2 Rep蛋白的23～25aa、256～258aa N-糖基化位点突变后降低病毒的复制能力而286～288aa突变后增强病毒的复制能力。 为深入了解PCV2 Rep蛋白N-糖基化位点突变对病毒复制和致病性的影响，在实验室前期构建好的平台上，用2M23、2M256、2M286和2PCV2拯救病毒株分别对BALB/c小鼠进行攻毒实验，进行抗体、病毒含量和免疫组织化学等的检测。结果显示，拯救突变病毒和未突变病毒均能在BALB/c小鼠体内进行复制，且具有致病性。