蛹虫草[Cordycepsp mliitaris(L.ex Fr.)Link]又名北虫草、北冬虫夏草、蛹草等,是我国著名的传统珍贵中药材之一。现代研究表明,蛹虫草具有与冬虫夏草(C.sinensis)极其相似的药理作用,可以作为冬虫夏草的代用品。蛹虫草中含有多种生理活性物质,其中蛹虫草多糖的含量最高,也是其主要活性成分之一。蛹虫草多糖有着多种生物活性功能,具有广泛的药理作用,是值得挖掘的一大生物资源宝库。同时蛹虫草多糖也是一种国际公认的免疫调节剂,在临床医学与预防保健中发挥着重要的作用。蛹虫草多糖锗(cordyceps polysaccharide germanium,CPG)是蛹虫草多糖和无机锗两者的结合体,为大分子有机锗。本实验以蛹虫草子实体和菌丝体为生物载体,运用生物工程技术,利用蛹虫草对锗具有的高度特异性富集功能,将无机锗(Ge02)按照一定浓度比例添加在固体和液体培养基中,蛹虫草在生长发育过程中,其菌丝体不断吸收培养基中的锗元素,被吸收的锗元素与蛹虫草体内的虫草多糖相结合,从而生成蛹虫草多糖锗。为了研究蛹虫草多糖锗的生物转化合成及其生物学活性,本项研究以蛹虫草为材料,运用固体培养和液体培养技术,系统地研究了蛹虫草多糖锗的生物转化合成、分离纯化、分子量及其单糖组成、安全性和抗衰老作用;同时探讨了蓝光对蛹虫草多糖锗和主要活性成分的促进作用;此外还研究了锗及其与硒协同对蛹虫草主要活性成分的影响。主要研究结果和结论如下:1、锗浓度对蛹虫草多糖锗的生物转化合成影响研究实验表明:锗浓度能显著影响蛹虫草子实体多糖化锗和菌丝体多糖化锗的生物转化(P<0.05)。在固体培养条件下,当锗浓度为200mg/L时,蛹虫草子实体的生物量最大,为5.95(g/瓶);锗浓度为300mg/L时,子实体多糖化锗的生物转化量最多,达到216.76(μg/g);锗浓度为250mg/L时,子实体有机锗转化率最高,为72.8%。在液体培养条件下,当锗浓度为250mg/L时,蛹虫草菌丝体的生物量最大为15.33(g/L);锗浓度为150mg/L时,菌丝体多糖化锗的生物转化量最多,达到107.29(μg/g);锗浓度为200mg/L时,菌丝体有机锗转化率最高,为85.1%。另外,在锗浓度为250mg/L时,子实体有机锗最高含量为489.86μg/g;在锗浓度为300mg/L时,子实体多糖化锗占子实体总有机锗比例最大为51.9%。在锗浓度为250mg/L时,菌丝体有机锗最高含量为584.76μg/g;在锗浓度为150mg/L时,菌丝体多糖化锗占菌丝体总有机锗比例最大为34.2%。总的来说,本研究显示锗浓度在150mg/L-300mg/L时,比较适合蛹虫草多糖化锗的生物转化。蛹虫草子实体对锗的富集及转化能力比菌丝体强。2、蛹虫草多糖锗的分离纯化、分子量以及单糖组成研究实验结果显示乙醇浓度、提取时间和子实体状态对从蛹虫草子实体中提取多糖锗有显著影响(P<0.05)。粉末子实体、2h提取时间、70%的乙醇浓度有利于蛹虫草多糖锗的提取。在用活性炭进行脱色时,2%的活性炭脱色处理效果最好。另外,子实体多糖锗与菌丝体多糖锗都是由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖四种单糖组成的;子实体多糖锗中这四种单糖的质量比为:1:2.7:91.5:7.1;菌丝体多糖锗中这四种单糖的质量比为1:1.1:39.7:3.5。子实体多糖锗的数均分子量(Mn)为 9.3733×10~4g/mol;重均分子量(Mw)为 4.9465×10~5g/mol;Z 均分子量(Mz)为 1.4283×10~6g/mol。3、蓝光诱导下蛹虫草锗及主要活性成分的动力学研究经过一个周期的蓝光诱导试验,结果显示试验组比对照组蛹虫草子实体的生物量提高了 26.5%。固体培养条件下,接种后36d时,有一半以上的有机锗是多糖锗。无论是蛹虫草子实体有机锗,还是菌丝体有机锗,其中50%以上均为多糖锗。蓝光诱导能提高蛹虫草多糖的含量,在子实体培养36d后,蓝光照射多糖含量达到5.91%,是白光对照刚开始检测时的3.078倍;在培养52d后,蓝光照射多糖含量达到6.42%,是白光对照刚开始检测时的3.344倍。在菌丝体培养5d后,蓝光照射多糖含量达到5.92%,是黑暗对照刚开始检测时的2.508倍;在培养8d后,蓝光照射多糖含量达到6.88%,是黑暗对照刚开始检测时的2.915倍。说明蓝光照射诱导对蛹虫草多糖具有显著的促进作用(P<0.05)。蓝光照射子实体样品组的虫草素含量普遍比白光对照组的虫草素含量要高,在52d时前者子实体虫草素含量是后者的1.44倍。菌丝体蓝光照射组的虫草素含量是黑暗对照组的1.297倍。经过蓝光照射诱导后,蛹虫草子实体多糖是一种含有鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖五种单糖的杂多糖,其中鼠李糖是新增的单糖,说明蓝光诱导对蛹虫草子实体多糖中单糖的组成种类和数量有显著的影响。菌丝体多糖的组成则没有变化。4、锗对蛹虫草子实体和菌丝体主要活性成分的影响不同浓度的锗对蛹虫草子实体和菌丝体中主要活性成分虫草素、腺苷和虫草多糖的含量都有不同程度的影响(P<0.05)。低浓度的锗可以促进这些活性成分的积累,而高浓度的锗对它们都有一定程度的抑制作用。对蛹虫草子实体来说,当培养基中锗浓度为250-300mg/L时,有利于虫草素、腺苷和虫草多糖这些活性成分的形成。对蛹虫草菌丝体来说,锗浓度为200mg/L时,可以促进这些活性物质的含量。由此可知,固体条件下培养蛹虫草子实体,其培养基中锗浓度要比液体条件下培养蛹虫草菌丝体的锗浓度高一点。从硒锗组合实验结果分析得知,适量的不同浓度硒锗组合处理对蛹虫草子实体中虫草素、腺苷和虫草多糖的产生都有不同程度的促进作用(P<0.05),特别是对虫草素的影响最大,最高达到了对照组的2.89倍。这一结果超过了硒或锗单独对虫草素的影响之和,表现出显著的协同正效应。提示我们在以虫草素为目标物的蛹虫草子实体栽培中,可以适当添加硒锗以提高虫草素的产量。对腺苷和虫草多糖而言,也表现出类似的情况(P<0.05)。因此,可以在培养基中同时加入硒锗来提高这些生理活性物质的产量。5、蛹虫草多糖锗的毒理安全性实验研究小鼠和大鼠的急性毒性试验表明蛹虫草多糖锗属无毒级;大鼠的长期毒性试验也表明蛹虫草多糖锗是一种无毒的有机锗(P>0.05)。Ames试验、小鼠骨髓细胞微核试验及小鼠精子畸变试验表明:蛹虫草多糖锗属于无毒物,致突变试验均为阴性(P>0.05),蛹虫草多糖锗无致突变作用。因此,蛹虫草多糖锗可以作为药品和保健食品的原料,在实验推荐的剂量下使用是安全的。6、蛹虫草多糖锗的抗衰老作用研究蛹虫草多糖锗对大鼠肝脏和脑中单胺氧化酶MAO活性影响的实验结果表明:蛹虫草多糖锗能显著影响雄鼠肝脏MAO活性和雌鼠脑MAO的活性(P<0.05)。雄鼠肝脏MAO活性随着蛹虫草多糖锗摄入剂量的增加而增加,二者呈正相关。连续饲喂26周,与对照组相比较,高剂量组雄鼠肝MAO活性则提高了 2.56倍,低剂量组雌鼠脑MAO活性降低36.9%。说明蛹虫草多糖锗具有抗衰老的作用。蛹虫草多糖锗对果蝇寿命影响实验表明:1.0%蛹虫草多糖锗可以有效的提高雌雄果蝇的平均寿命、最高寿命和半数死亡时间(P<0.05、P<0.01)。其中雄性果蝇平均寿命比对照组延长25.7%,最高寿命延长11.5%,半数死亡时间延长22.93%;雌性果蝇平均寿命比对照组延长44.12%,最高寿命高于对照组40.81%,半数死亡时间比对照组延长46.19%。蛹虫草多糖锗对雌性果蝇寿命的影响大于对雄性果蝇寿命的影响。本研究的创新点在于:(1)从蛹虫草的固体培养和液体培养两方面,首次系统地研究了蛹虫草多糖锗的生物转化合成。发现了蛹虫草子实体富锗能力比菌丝体强,从而为富锗蛹虫草的进一步研究打下了良好的基础。(2)首次研究了蛹虫草多糖锗的分子量及单糖组成。确定了蛹虫草多糖锗属于天然高聚物,是一种大分子有机锗。并明确了它的单糖组成。(3)首次研究了蓝光诱导下蛹虫草锗及主要活性成分的动力学过程。为蛹虫草主要活性成分含量的提高提供了一条可行途径。(4)首次系统地研究了蛹虫草多糖锗的毒性,确定了蛹虫草多糖锗为无毒物,蛹虫草多糖锗作为药品和保健食品,在实验推荐的剂量下使用是安全的。这一结果对于以后开发多糖锗抗肿瘤新药起着重要的作用。(5)首次研究了蛹虫草多糖锗对大鼠肝脏和脑中单胺氧化酶活性的影响。肯定了蛹虫草多糖锗具有抗衰老作用。本论文对蛹虫草多糖锗的研究结果不仅开拓了蛹虫草多糖研究的新领域,为富锗蛹虫草的进一步开发利用奠定了良好的基础,而且还为开发研究对人体有益,且安全、高效,又具有生理活性的功能性食品和医用药源提供了理论支持。因此具有重要的社会经济意义和很大的应用价值。