柠檬(Citrus Limon)作为药食两用的水果具有怡人的香味、丰富的营养物质和活性成分。柠檬见于世界各地,久负盛名当属四川省安岳县的柠檬,其享有“中国柠檬看四川,四川柠檬看安岳”的美誉。其栽培的“尤克力”柠檬产量高、营养物质含量丰富、出汁率高达38%,是理想的既能鲜食又能加工的优良品种。本课题以“尤克力”柠檬为研究对象,筛选出了适合制备柠檬多肽的蛋白酶,探究了柠檬多肽酒的最佳发酵工艺条件和澄清工艺,进行了柠檬多肽酒的挥发性成分分析,并对柠檬多肽水解液发酵前后进行了柠檬多肽的定性分析。试验主要结论如下:(1)制备柠檬多肽的筛选工艺:以酶解法制备柠檬多肽。选取了七种常见的蛋白酶做筛选试验,初步筛选出了水解效果较好的风味蛋白酶、胰蛋白酶和菠萝蛋白酶。通过单因素考察了这三种蛋白酶在水解温度、酶解时间和加酶量三个因素下对柠檬蛋白水解的影响,以水解液中的多肽含量为指标,根据多肽含量的标准曲线,测定其样品的吸光度,筛选出了酶解效果比较好的两种酶:风味蛋白酶和胰蛋白酶。(2)优化蛋白酶解工艺:根据多肽含量标准曲线,以吸光值为指标,通过正交试验优化风味蛋白酶和胰蛋白酶的酶解工艺条件得出了最佳水解条件:风味蛋白酶水解温度为50℃、水解时间为4h、加酶量为2%;胰蛋白酶的水解温度为35℃、水解时间为8h、加酶量为1.5%。(3)柠檬多肽酒发酵工艺优化:本试验以酒精度、残糖含量、总酸和感官评分等作为指标,将酶解液进行了发酵研究。选取初始糖度、酵母接种量和发酵温度三个因素,通过单因素试验探究对柠檬发酵酒影响的3个较优水平作进一步优化。以感官评分作为指标,利用Design Expert 8.0.6软件的Box-Behnken法进行三因素三水平的响应面设计和分析得出了柠檬多肽酒发酵工艺的模型方程为:Y=86.42+0.99A+1.19B+1.85C-0.32AB+0.60AC+1.80BC-7.22A~2-2.72B~2-3.55C~2其中,A为初始糖度、B为酵母接种量、C为发酵温度,相关系数R~2=0.9961,该模型方程具有较高的拟合度。根据方差分析得到:一次项A、B、C、二次项A~2、B~2、C~2和交互项BC对感官评分的影响极显著,交互项AC对感官评分的影响显著,交互项AB对感官评分的影响不显著。通过响应面分析优化后,结合实际操作情况最终得出柠檬多肽酒发酵的最佳工艺参数:初始糖度为26%,酵母接种量为0.17%、发酵温度为28℃。(4)柠檬多肽酒的澄清:本文通过单因素试验,以柠檬多肽酒的透光率和感官评价为指标,研究了常用的明胶、壳聚糖、皂土三种澄清剂的配制比例及澄清效果。结果表明:明胶>壳聚糖>皂土,采用明胶对果酒进行澄清后,可大大提高其感官评分。(5)挥发性成分分析:通过HS-SPME-GC-MS分析法,从两种柠檬酒中共检索出挥发性成分45种,其中醇类16种、脂类13种、酸类4种、烷烯醚类7种、醛酮类3种及其他物质2种。分别在柠檬果酒中检测到挥发性成分有95.20%,计43种;柠檬多肽酒中检测到挥发性成分有94.61%,计38种。两种柠檬酒中的主要挥发性成分是醇类,其次是酯类、烷烯醚类、酸类。柠檬果酒中的酯类、酸类、烷烯醚类等物质相对含量均高于柠檬多肽酒,而柠檬多肽酒的醇类物质比柠檬果酒高。主要挥发性成分均有12种,柠檬果酒的主要挥发性成分含量为83.12%,占总挥发性物质的87.31%;而柠檬多肽酒为84.20%,占总挥发性物质的89.00%。说明风味蛋白酶不会对柠檬果酒香气成分造成不良影响,且能在一定程度上提高酵母的产酒能力(6)柠檬多肽的HPLC定性分析:分别从柠檬水解液和柠檬多肽酒中分离提取柠檬多肽,以重组胰岛素为标准品,柠檬多肽为样品,经HPLC法分析得出在标准品相同的保留时间内柠檬多肽分别也出现了色谱峰。由此可推断出,柠檬蛋白酶解液发酵前后柠檬多肽粗提物中含有与重组胰岛素结构类似的物质,柠檬多肽可能具有和重组胰岛素类似的降血糖活性,有关柠檬多肽降血糖的生物活性研究有待进一步深入开展。