作为一种重要的形态发生素(morphogen)，视黄酸(RA)在脊椎动物的早期胚胎发育中发挥着十分重要的作用。在胚胎发生中，RA通过激活核受体，然后结合到靶基因的视黄酸反应元件(RARE)上来调控基因的表达，从而指导胚胎的前后、左右及背腹轴的建立，决定体节和中枢神经系统等的发生。缺少内源性RA胚胎发育异常，但过量RA同样会导致胚胎严重畸形。尽管有关RA信号在发育中的作用已进行了广泛的研究，但相关作用的详细机制远未了解，特别是在发育过程中如何对内源性RA的恰当限制仍知之甚少。现在有关RA在脊椎动物胚胎发育中作用的研究是发育生物学研究的热点领域之一。斑马鱼是近年来发展起来的被广泛用于发育生物学研究的热点模式脊椎动物。因此，利用斑马鱼开展RA信号、特别是恰当抑制RA信号在早期发育机制的研究对进一步了解恰当的RA信号在脊椎动物胚胎发生中的作用有着十分重要的意义。 应用外源性RA处理斑马鱼的胚胎，我们发现与缺乏内源性RA一样，过量视黄酸信号也导致体节发生左右不对称，并同时引起体节周期性基因(包括deltaC、her1和her7)的对称表达失常。而当用低至1×10-11M浓度的RA前体维生素A处理斑马鱼胚胎时，决定体节发生的体节周期性基因(包括deltaC、her1和her7)的表达同样出现了左右不对称。这表明在分子水平上，极低的RA信号就具有分子致畸作用。因此，胚胎需要拥有一个机制确保某些不需要RA信号的胚胎部分免受RA的损害。已知哺乳动物中有三个细胞色素P450RA家族的酶(Cyp26)可以将RA代谢成非生物活性的视黄酸代谢物。但迄今斑马鱼中仅发现两个直系同源基因。在本研究中，运用末端快速扩增(RACE)技术，我们克隆了一个新的斑马鱼cyp26基因—cyp26d1。cyp26d1预测编码一个含554个氨基酸的蛋白。蛋白质序列比对发现Cyp26D1与其它Cyp26家族的成员享有高度氨基酸序列的一致性和相似性。通过反相高压液相色谱分析，我们证实在293T细胞中过表达的斑马鱼Cyp26D1可以代谢全反式视黄酸、九位顺式视黄酸和十三位顺式视黄酸，但是不能代谢视黄醇或者视黄醛。Cyp26D1产生的全反式视黄酸的代谢产物与Cyp26A1产生的代谢产物相同，主要是四位羟基全反式视黄酸和四位酮基全反式视黄酸。通过胚胎显微注射斑马鱼Cyp26D1的mRNA，我们证实Cyp26D1在胚胎中过表达不仅会引起第五菱脑和第一体节间的距离变短，而且会导致体节发生的左右不对称。这些变化与cyp26a1过表达及用1 μM 4-二乙氨基苯甲醛-N，N二苯腙(RA合成抑制剂)处理胚胎的表型非常相似，这表明cyp26d1可以在体内拮抗视黄酸。这些体内和体外的结果均表明斑马鱼的cyp26D1与其它Cyp26一样都可以通过代谢RA限制RA信号。通过整体原位杂交，我们发现cyp26d1在胚胎的后脑发育中呈动态的特异时空表达模式。在成体中，cyp26d1广泛表达在不同的器官组织中。cyp26d1的这种广泛分布，表明它在后脑发生中可能通过限制RA信号发挥着重要作用。 对RA信号的恰当限制除了通过CYP26实现外，在RA信号系统中还存在着另一种很重要的转录抑制因子-N—CoR(核受体辅阻遏物)在起作用。与RA转录激活的作用相反，N—CoR在不存在RA的细胞内作为辅阻遏物辅助RA受体执行转录抑制的功能。N—CoR被发现存在于多种脊椎动物中。敲除N—CoR基因的小鼠，胚胎死于怀孕后的第16天。但是，在斑马鱼中迄今尚未有关于N—CoR的报道。运用RACE策略，我们克隆了斑马鱼的n-cor基因。n-cor预测编码一个含2409个氨基酸的蛋白。蛋白质序列比对发现斑马鱼的N—CoR与已知的其它动物N—CoR氨基酸序列的相同性在57％以上。蛋白质序列系统进化分析结果支持斑马鱼的N—CoR是哺乳动物的直系同源基因。整体原位杂交的结果表明N—CoR的mRNA在斑马鱼胚胎的早期发育中广泛存在。通过显微注射在斑马鱼胚胎中过表达N—CoR或者显性负效突变的N—CoR—(dnN—CoR)而增加或减弱N—CoR 功能时，我们的研究结果发现对于后脑发育很重要的转录因子包括Hoxa2b、Hoxbla，Hoxb4a、Vhnfl、Val和Krox-20的表达以及后脑前后轴的长度都发生了改变，而且这种改变非常类似于减弱或加强内源性RA信号引起的胚胎表型。而当N—CoR或者dnN—CoR与视黄酸受体(RARa2b)共同过表达时，胚胎的表型则被加强或者拯救。因此，我们的这些结果首次证明N—CoR通过视黄酸受体介导主动抑制视黄酸信号从而在脊椎动物后脑的发育中发挥着重要作用。综上所述，我们的研究结果证实通过Cyp26和N—CoR对视黄酸信号的恰当抑制是胚胎正常发育所必需的。