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背景疼痛是大多数疾病具有的共同症状,是人类共有而个体差异很大的一种不愉快的感觉。疼痛按其发生的部位、性质、起因和时程,可将疼痛划分为:急性痛、炎症性痛和神经病理性痛,后两者属于病理性痛或慢性痛。急性疼痛是各种伤害性刺激作用于机体而产生的即时性疼痛,主要是通过兴奋伤害性感受器而产生,故又称之为伤害感受性疼痛。慢性痛包括炎症痛、神经病理痛、癌症痛,是临床上常见主诉之一。烧伤是严重的创伤,疼痛往往是烧伤患者的第一反应,烧伤后疼痛是由于烧伤部位皮肤的伤害性感受器受刺激,并伴随着炎症反应和神经损伤所引起的,因此它的治疗需要结合伤害性感受处理和神经病理处理。目前常用的镇痛药有阿片类物质,但这类药物可能引起呼吸抑制、意识不清、胃肠蠕动抑制、尿潴留、恶心呕吐、以及药物依赖等副作用。此外,阿片类药物药效会发生改变,需要不断增加剂量,甚至大剂量应用也不能完全缓解疼痛。目前对慢性痛(如神经病理痛)也没有特效镇痛药,其治疗也是临床上的难题。因此,对疼痛形成机制及寻找新的镇痛药物研究成为疼痛领域研究的热点和重点。英国“自然”杂志发表的论文显示嘌呤受体中的P2X3受体在背根感觉神经元特异表达,参与疼痛的信息传递。嘌呤受体分为P1和P2受体,ATP及其类似物作用于P2受体。疼痛、伤害性剌激使损伤细胞、应激细胞以及感觉神经末梢本身释放大量ATP,引起神经性P2X受体兴奋性激活,从而诱发动作电位沿着神经轴突向中枢神经系统传递。由此提示特异性的P2X3受体阻断剂将可能成为新的镇痛药物。中药川芎味辛,性温,入肝胆、心包经,能活血行气,祛风止痛。川芎嗪(tetramethylpyrazine TMP)是川芎的有效成份之一,属酰胺类生物碱,化学结构为四甲基吡嗪,临床上主要用心血管疾病的治疗。研究报道TMP具有抗炎作用,可明显抑制白细胞和小胶质细胞的浸润及激活,炎症与伤害性反应密切相关,表明川芎嗪可能具有抗伤害性作用。前期实验观察到川芎嗪可抑制ATP引起的足底伤害性反应,提示川芎嗪可能阻断P2X受体产生镇痛作用。为此,通过国家自然科学基金资助课题的研究,观察到川芎嗪可抑制P2X受体兴奋介导的大鼠急性伤害性反应,进而应用免疫组化或原位杂交技术观察川芎嗪对烧伤模型大鼠脊髓和感觉神经末梢P2X3受体表达的作用及对神经病理痛(坐骨神经慢性压迫损伤,CCI)模型大鼠背根神经节P2X3受体的表达的作用,并同时用全细胞膜片钳技术观察川芎嗪对烧伤模型和CCI模型大鼠背根神经节神经元细胞ATP激活电流的影响,这些实验试图了解川芎嗪对P2X3受体介导的急、慢性疼痛的影响,扩大中药川芎嗪的应用范围,为防治烧伤疼痛和神经病理痛探索新方法。第一部分川芎嗪对P2X受体介导的急性伤害性反应的作用目的:观察川芎嗪(TMP)对初级感觉神经元嘌呤2X (P2X)受体介导的急性伤害性反应的影响。方法:通过大鼠痛行为反应确定局部和鞘内应用TMP对P2X受体激动剂[三磷酸腺苷(ATP)和α,β亚甲三磷酸腺苷(α,β-meATP)]所致大鼠足底伤害性反应的影响。应用细胞内记录,在大鼠新鲜分离的背根神经节(dorsal root ganglion,DRG)标本上观察川芎嗪对P2X受体激动剂ATP激活膜去极化电位的作用。结果:局部应用TMP (10 mmol/L )明显抑制ATP (1μmol/L )或α,β-meATP(0.6μmol/L )引起的大鼠足底急性伤害性反应,炎症介质PGE2 (5μmol/L )增强α,β-meATP(0.2μmol/L )引起的急性伤害性反应, TMP (10 mmol/L )可抑制加PGE2 (5μmol/L)加α,β-meATP(0.2μmol/L )引起的伤害性反应。鞘内应用TMP(50 mmol/L)对ATP (1μmol/L)或α,β-meATP (0.6μmol/L)引起的伤害性反应具有抑制作用。细胞内记录表明TMP(300μmol/L)可抑制ATP或α,β-meATP引起的背根神经节细胞膜去极化电位。结论: TMP可通过抑制初级感觉神经元P2X受体兴奋介导的信息传递产生抗伤害性反应作用。第二部分川芎嗪对P2X3受体介导的神经病理痛的作用目的:了解川芎嗪(TMP)对P2X3受体介导神经病理痛的作用。方法:建立大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤(CCI)神经病理痛模型,应用von Frey细丝法和热辐射法测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)和热缩足反射潜伏期( thermal withdrawal latency,TWL),观察TMP对CCI大鼠MWT和TWL的影响,结合免疫组织化学方法和原位杂交方法观察大鼠L4/L5段脊髓和背根神经节(DRG)P2X3受体的表达变化,并应用全细胞膜片钳技术了解川芎嗪对背根神经节神经元ATP激活电流的影响。结果:术后14d,Ⅴ组(CCI模型组)与Ⅰ组(生理盐水对照组)、Ⅱ组(TMP对照组)、Ⅲ组(假手术组)、Ⅳ组(CCI模型+TMP治疗组)相比显示大鼠后足的机械和热痛敏阈值明显降低(p<0.05),大鼠脊髓和背根神经节P2X3受体表达明显升高(p<0.05);Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组之间相比显示大鼠后足的机械和热痛敏阈值无显著性差异(p>0.05),大鼠脊髓和背根神经节P2X3受体表达无显著性差异(p>0.05);Ⅳ组大鼠脊髓和背根神经节P2X3受体的表达较Ⅴ组低(p<0.05)。Ⅴ组DRG神经元细胞ATP激活电流与Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组比较明显增强(p<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ组之间相比较无显著性差异(p>0.05)。结论:川芎嗪对初级感觉神经元P2X3受体介导的神经病理痛具有抑制作用。第三部分川芎嗪对P2X3受体介导烧伤痛的作用目的:探讨川芎嗪(TMP)对P2X3受体介导的烧伤痛的作用。方法:建立大鼠Ⅰ度和浅Ⅱ度烧伤动物模型,应用von Frey细丝法和热辐射法测定机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)和热缩足反射潜伏期( thermal withdrawal latency,TWL),观察川芎嗪对烧伤大鼠MWT和TWL的影响,结合免疫组织化学方法观察川芎嗪对大鼠烧伤皮肤神经末梢P2X3受体表达的影响,并应用全细胞膜片钳技术检测浅Ⅱ度烧伤大鼠背根神经节神经元细胞ATP激活电流的变化及川芎嗪的作用。结果:烧伤后1h,ⅢA (足部Ⅰ度烧伤+NS组)和ⅢB组(足部浅Ⅱ度烧伤+NS组)机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期显著性下降,分别持续24h和96h(p<0.01)。烧伤后24h,ⅡA组(足部Ⅰ度烧伤+TMP组)机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期与Ⅰ组(足部假烫组)比较无显著性差异;而ⅡB组(足部浅Ⅱ度烧伤+TMP组)于24h后与Ⅰ组比较有明显增加,72h后ⅡB组与Ⅰ组(足部假烫组)比较无显著性差异。烧伤后3d,ⅥA组(背部Ⅰ度烧伤+NS组)和ⅥB组(背部浅Ⅱ度烧伤+NS组)大鼠烧伤皮肤神经末梢P2X3受体表达明显升高;ⅤA组(背部Ⅰ度烧伤+TMP组)和ⅤB组(背部浅Ⅱ度烧伤+TMP组)烧伤皮肤神经末梢P2X3表达与未用药的模型组相比明显下降(p<0.05)。ⅥB组DRG神经元细胞ATP激活电流和Ⅳ、ⅤB组比较明显增强(p<0.05),Ⅳ(背部假烫组)与ⅤB组之间相比较无显著性差异(p>0.05)。P2X3受体激动剂α,β-meATP( 10μmol/L )-激活电流在Ⅳ、ⅤB组产生极小的内向电流,而在ⅥB组为一具有明显去敏感的内向电流(P<0.01)结论:川芎嗪可抑制初级感觉神经元P2X3受体介导的烧伤痛。