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研究背景:急性髓系白血病(Acute Myeloid Leukemia,AML)是源于造血干细胞的恶性血液病,不同AML亚型患者之间的临床特征、治疗效果及预后存在着明显差异,这种异质性与各亚型之间的遗传学异常密切相关。目前AML的遗传学异常仍未完全阐明。因此,发现AML相关新基因并对其在AML发病机制中的作用进行深入研究仍是一个重要的课题。家族性AML的基因资源具有独特的研究价值,从研究AML高发家系入手,更容易发掘出AML相关基因异常,并将其推广应用于散发AML中,有助于阐明AML发病的分子机制。我们利用一个国内外罕见、高发的AML家系患者的基因资源,在国际上首先成功克隆出AML相关新基因Homo sapiens familial acute myelogenous leukemia related factor(FAMLF)的cDNA全长;生物信息学分析发现其至少存在3个以上的剪接变异体,将其命名为FAMLF-1、FAMLF-2及FAMLF-3,并在FAMLF基因家族的内含子区域发现miR181a1/b1;并发现FAMLF-1、FAMLF-2转录本在家系与散发AML外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中的表达水平比在正常人PBMCs中的表达水平显著增高,其中FAMLF-1异常高表达尤为明显。我们推测FAMLF-1可能在AML发生发展中发挥一定作用。为进一步探索、研究FAMLF基因在AML发生发展中的作用机制,本课题拟进一步验证FAMLF-1 mRNA的全长、明确FAMLF-1是否编码蛋白;分析与研究FAMLF-1与miR181a1在AML患者中表达情况,及其与AML临床血液病学特征的关系;分析与研究FAMLF基因家族突变谱及其在AML患者中的临床意义;并在细胞水平下调FAMLF-1的表达,以探讨FAMLF-1在AML中的可能作用机制。目的:分析与研究FAMLF-1在AML中表达、突变情况及其临床意义,探索与阐释FAMLF-1在AML中发挥作用的可能分子机制。方法:本课题首先应用Northern blot分析FAMLF-1转录本的大小;预测、合成FAMLF-1的免疫表位多肽,制备出兔源FAMLF-1抗体,Western blot证实其开发读码框;应用SYBR Green QRT-PCR检测FAMLF-1在AML中的表达水平,并分析其临床意义;采用Taqman探针法实时定量PCR检测miR-181a1在AML中的表达水平,并分析其与FAMLF-1表达水平的相关性;Sanger法直接测序描绘FAMLF基因家族所有外显子及miR-181a1/b1在AML患者中的突变图谱,并分析其突变的临床意义;通过RNA干扰策略,构建FAMLF-1-RNAi载体,特异性沉默FAMLF-1的表达,包装重组慢病毒,感染Kasumi-1细胞株,与空载体对照组比较,观察与分析FAMLF-1下调对Kasumi-1细胞生物学特性的影响,初步探讨FAMLF-1参与AML的分子机制。结果:1、Northern blot结果证实FAMLF-1的全长为2.3kb,该基因在AML患者与细胞株中高表达;Western blot分析证实FAMLF-1编码分子量约8kd的蛋白,该蛋白在AML患者及细胞株中高表达。2、实时定量PCR检测显示,FAMLF-1在AML患者中的表达水平比正常人中高(P<0.0001),进一步统计分析显示其在急性粒细胞白血病部分分化型(M2)患者中的表达水平比非M2(non-M2)患者高(P=0.0152)。3、AML患者的FAMLF-1表达水平与AML外周血幼稚细胞比例、血红蛋白浓度和血清HBDH浓度有关(P值均小于0.05),进一步统计分析显示在M2患者中的FAMLF-1表达水平与外周血幼稚细胞比例、白细胞计数、血红蛋白浓度和血清HBDH浓度有关(P值均小于0.05),而在non-M2亚型AML患者中FAMLF-1表达水平与外周血幼稚细胞比例、白细胞计数、血红蛋白浓度和血清HBDH浓度无明显关系(P>值均大于0.05)。4、FAMLF-1高表达的AML患者CR率较高(P<0.05),而RFS、远期OS较低(P<0.05);FAMLF-1高表达M2患者的CR率较高(P<0.05),FAMLF-1的表达水平与non-M2的CR率无关(P>0.05)。5、FAMLF-1与其内含子miR-181a1之间的表达水平正相关(P<0.05)。6、基因分型、单倍型分析及关联分析显示,FAMLF基因家族的GTAGG单倍型是M2患病危险性增高的因素(OR=1.92.3,95%CI:1.0201-3.6250,P=0.0419)。7、成功构建出pGV248/GFP-FAMLF-1-RNAi载体。8、通过慢病毒载体介导,将FAMLF-1-RNAi-LV转染Kasumi-1细胞,实时定量PCR检测,发现转染细胞的FAMLF-1敲减效率接近70%(P<0.05),表明构建Kasumi-1细胞的FAMLF-1基因沉默的细胞模型是成功的。9、通过绘制生长曲线、克隆形成实验、流式细胞术、实时定量PCR、Western blot等技术检测FAMLF-1基因沉默后对Kasumi-1细胞生物学特性的影响,发现FAMLF-1基因沉默可抑制Kasumi-1细胞增殖,使细胞周期阻滞于G0/G1期,促进Kasumi-1细胞分化成熟,可能与Akt通路有关。此外FAMLF-1基因沉默后,其内含子miR-181a1的表达水平未降低。结论:1、FAMLF-1全长为2313bp,可编码约8kd蛋白;该基因在AML、特别是M2中高表达,该基因高表达与AML、特别是M2的血液病学特征密切相关;该基因中存在导致M2患病风险增高的SNP单倍型-GTAGG单倍型。2、FAMLF-1基因沉默可抑制Kasumi-1细胞的增殖、导致细胞周期G0/G1期阻滞、促进细胞分化,提示FAMLF-1可能通过Akt通路等参与AML发生发展过程。