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牛乳中蛋白质含量丰富,其中酪蛋白经体外酶解可产生不同功能的活性肽,已有动物体内实验证实这些肽类具有生理作用。这些活性肽多由3个以上氨基酸残基组成,但对大于3个氨基酸残基的多肽肠道吸收形式和吸收机制研究较少,阐明多肽的肠道吸收机制对活性肽的作用机理及功能评价显得尤为重要。本课题以牛乳酪蛋白为原料,对其进行体外模拟消化,探讨胃肠消化条件下的ACE(血管紧张素转化酶)抑制肽及抗氧化肽活性,RP-HPLC分析水解液组成变化,LC-MS/MS鉴定肽段序列;再通过体内消化荧光标记的牛乳酪蛋白,利用激光共聚焦显微镜、RP-HPLC及全波长功能读数仪检测FITC-酪蛋白水解物在大鼠肠道粘膜上的吸收情况;最后,建立Caco-2单层细胞模型,通过添加不同抑制剂研究6种ACE抑制肽在细胞水平的吸收形式及吸收机制。主要研究结果如下:1.体外模拟消化牛乳酪蛋白水解物的生物活性研究。模拟胃、肠及胃肠联合水解三种消化方式中,胃肠模拟消化的水解度最大,为25.51±0.41%;通过ACE法及DPPH自由基法分别对水解液中ACE抑制活性及抗氧化活性进行检测,在消化1 h内,三种消化方式的DPPH自由基清除率都增加较快,分别增加了18.25±0.72%、25.82±1.15%和41.78±0.71%,在2h时胃肠联合消化的DPPH自由基清除率达到最大为44.27±0.93%;胃肠联合水解液的ACE抑制率显著高于两种单独消化方式,并在消化2h时ACE抑制活性达到最高值68.03±1.14%。分析LC-MS/MS二级质谱鉴定结果,发现可能具有ACE活性的肽段有21种,活性还需进一步验证。2.FITC-牛乳酪蛋白大鼠体内吸收研究。采用FITC(异硫酸荧光素)标记酪蛋白,对标记率为13.91%的样品使用SDS-PAGE电泳评价FITC-酪蛋白在胃肠消化液中的稳定性。结果表明人工胃液和肠液消化5 h,消化液的分子量为11 kDa左右,且荧光条带清晰;Tricine-SDS-PAGE电泳检测胃肠消化液,2 h蛋白条带主要集中在5 kDa以下,荧光条带清晰,可用于跟踪胃肠吸收情况。FITC-酪蛋白大鼠灌胃实验得出,在灌胃1h后十二指肠粘膜下层的荧光强度为1047.12±157.82 RFU,占总荧光强度的3.3%,灌胃3 h荧光显著增强达到2073.44±119.31 RFU,占总荧光强度的6.5%,激光共聚焦显微镜观察可知酪蛋白水解物在大鼠体内可被很快吸收。建立大鼠肠非翻转模型,验证5 kDa以下的FITC-酪蛋白水解液被小肠不同肠段的吸收率大小依次为:十二指肠吸收>空肠吸收>回肠吸收>结肠吸收,且主要被十二指肠吸收。3.基于Caco-2细胞模型的ACE抑制肽吸收机制研究。Caco-2单层细胞膜模型指标评价结果为:培养16天时细胞形态良好,生长均匀,单层膜基本成型;荧光黄的Papp为6.06×10-7;15天时AP/BL侧酶活比为7.60,说明碱性磷酸酶已经主要分布于AP侧,极化现象已经很明显;单层膜的电阻为417Ω·cm2,以上各条件均已符合Caco-2单层膜的要求,说明Caco-2单层细胞模型建立成功。选择胃肠消化条件下产生的6种ACE抑制肽:IPP、RYLGY、LHLPLP、AYFYPEL、RPKHPIKHQ及WQVLPNAVPAK。合成6种ACE抑制肽探讨其转运机制。以RYLGY为模型,对影响ACE抑制肽的跨膜转运量的主要因素进行优化,确定最佳转膜条件为多肽浓度5 mmol/L、转运时间90 min、pH 7.4及转运方向由AP-BL。采用跨膜转运抑制剂氧化苯胂、去氧胆酸钠、Gly-pro、维拉帕米、叠氮化钠及MK-571钠盐研究6种ACE抑制肽吸收机制。6种ACE抑制肽的吸收和外排机制如下:6种ACE抑制肽均是以旁路转运的方式通过小肠上皮细胞;IPP可能存在能量依赖性的外排作用;RYLGY、LHLPLP和RPKHPIKHQ均是以P糖蛋白进行外排转运并且需要ATP提供能量;AYFYPEL是以P糖蛋白的方式进行外排转运;WQVLPNAVPAK则是以MRP2进行外排转运且需要ATP提供能力。RP-HPLC表明6种肽均能完整通过Caco-2单层细胞膜,最后通过LC-MS/MS对BL侧三个长肽进行检测发现,三种长肽在小肠上皮细胞都会被部分水解,仅有一部分以完整的形式通过Caco-2单层细胞膜。对牛乳酪蛋白进行胃肠模拟消化,能够产生具有生理活性肽段,通过在体消化FITC-酪蛋白得出水解物中的多肽可能被肠道吸收,Caco-2细胞模型吸收机制研究表明,鉴定得到的6种ACE抑制肽可被肠上皮细胞完整吸收,长肽段有部分水解,其吸收机制均为旁路转运。