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畜禽抗生素的滥用对畜禽产品造成了药物残留和耐药性菌株的污染等问题,严重危害了动物性食品的质量与安全,造成了严重的社会公共卫生和食品安全。动物微生态制剂是绿色抗生素替代品之一,具有广泛的应用价值。乳酸菌是研制动物微生态制剂的典型菌种,对动物肠道内环境微生态的稳定具有调节作用,对宿主肠道疾病具有防治作用。鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)是危害养鸡业最严重的肠道细菌病之一,是重要的公共卫生问题。防治S.pullorum对鸡的感染,对保障家禽健康养殖和动物性食品质量与安全具有重要的意义。在乳酸菌属中,乳酸杆菌是最主要的一类,其中包括干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)、嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)等。L.fermentum天然存在肠道具有很强的胃肠道环境耐受力等优点,有关其在预防和治疗S.pullorum感染的报道较少。因此,本研究旨在体外筛选出能抑制S.pullorum生长的乳酸菌株,以此为基础,研究其体内外对S.pullorum的抗感染作用,进一步阐述乳酸菌对鸡抗病原菌感染的保护性作用研究。具体研究内容和结果如下:1.乳酸菌理化特性及抑菌活性比较在本实验室乳酸菌筛选的基础上,选取L.casei1.2435、L.fermentum1.2133、L.acidophilus1.1854、S.thermophillus 1.2471,4株乳酸菌进行抑菌特性比较分析。通过耐酸性和胆盐耐受实验、细胞黏附实验、疏水性实验、抑菌实验进行乳酸菌理化特性比较。实验结果表明,4株乳酸菌在pH值2.5的培养基中培养2h后,L.fermentum1.2133的存活率达到68%,显著高于其他3株菌。在胆盐浓度为0.3%的培养基中培养2h后,L.fermentum1.2133存活率大于60%。表面疏水性实验结果表明,各菌株间比较差异显著,L.fermentum 1.2133具有较高的表面疏水性;各菌株对目标菌株均具有凝聚能力,其中L.fermentum1.2133自聚合能力最强。抑菌实验结果表明,4株乳酸杆菌对病原菌E.coli AE17、E.coli O78以及S.pullorum CVCC533均具有一定的抑菌能力,且存在菌株差异性。L.fermentum1.2133对S.pullorum CVCC533有显著的抑菌能力,L.acidophilus1.1854对E.coli AE17抑菌活性显著,L.casei1.2435对E.coli O78抑菌能力显著,S.thermophillus1.2471抑菌活性较弱。2.L.fermentum1.2133拮抗S.pullorum CVCC533体外抑菌作用观察采用荧光显微镜对L.fermentum1.2133发酵上清作用于S.pullorum CVCC533生物被膜中细菌的生存能力进行观察,在L.fermentum1.2133发酵上清液与S.pullorum CVCC533共培养24h后,显微镜中观察到实验组中S.pullorum CVCC533的生物被膜中S.pullorum CVCC533菌体大部分呈现红色荧光,只有少量点状的绿色荧光;对照组视野中基本为绿色荧光,仅有少量红色荧光。在体外对L.fermentum1.2133与S.pullorum CVCC533进行竞争性共培实验的结果表明,在0-18h,L.fermentum1.2133对S.pullorum CVCC533的生长抑制随着时间的推移逐渐增强,S.pullorum的数量逐渐减少,到18h后,趋于稳定。L.fermentum1.2133对S.pullorum CVCC533生长具有拮抗作用,且不同的初始菌液浓度形成的竞争性效果存在差异,菌液浓度10:1的竞争性优于1:1。3.L.fermentum1.2133对感染S.pullorum CVCC533的鸡肠道菌群和组织病理学观察将120只1日龄的罗曼肉鸡随机分为4个组,分别为对照组(第I组)、1日龄开始灌喂L.fermentum1.2133(2.5×108 cfu/chick)组(第II组)、1日龄开始灌喂L.fermentum1.2133至14日龄攻毒S.pullorum CVCC533(5×108 cfu/chick)的预处理组(第III组)以及第14日龄直接感染S.pullorum CVCC533组(第IV组),分别进行肠道细菌计数和病理切片观察。结果表明,鸡感染后24h,回肠和盲肠细菌数均发生变化,第II组乳酸菌数量显著高于第III组、第IV组,而沙门氏菌数量明显有所减少,好氧菌总数增多。第II组鸡的十二指肠、空肠、回肠肠状态正常,肠绒毛完整,无明显病理变化较第I组鸡小肠形态发育更完整;第III组鸡十二指可见肠绒毛固有层出现轻微肠炎性细胞侵润;空肠绒毛中心轴有部分红细胞,回肠绒毛表现局部损伤。第IV组十二指肠绒毛断裂,绒毛自溶现象明显,空肠绒毛中心轴红细胞累积,回肠肠绒毛上皮的杯状细胞被溶解,绒毛自溶现象明显,第III组与第IV组相比较,鸡小肠各肠段的炎症和出血点等症状减轻。4.L.fermentum1.2133对感染S.pullorum CVCC533的鸡肠道AvBD2 mRNA转录水平的影响本实验采用RT-PCR方法,测定了L.fermentum1.2133对感染S.pullorum CVCC533的鸡肠道AvBD2 mRNA的转录水平。在鸡感染72 h内(0 h,12 h,24 h,36、48h和72h)采鸡小肠各段组织。结果表明,AvBD2在小肠各段中均有表达。在整个时间段内,第II组AvBD2 mRNA的转录水平在鸡小肠内的转录水平基本呈稳定趋势且转录水平显著高于第I组。第III组和第IV组小肠段AvBD2 mRNA的转录水平与第II组差异显著;第III组在24h后,AvBD2 mRNA的转录水平基本呈波动性变化趋势降低,第IV组呈显著性下降,都显著低于第I组转录水平,实验结果表明,L.fermentum1.2133对鸡肠道防御素AvBD2的表达具有调控作用。上述研究表明,L.fermentum1.2133对鸡肠道内环境具有很好耐受能力,且其发酵上清液对S.pullorum CVCC533生物被膜的中S.pullorum CVCC533有显著的抑菌作用;能稳定定植于肠道,对鸡肠道菌群有调节作用,同时还能促进鸡小肠内β-防御素2的表达量,在抗S.pullorum CVCC533感染过程中发挥着重要的作用。