研究背景和目的：脊髓损伤(Spinal cord injury, SCI)是一种严重的中枢神经系统(Central nervous system, CNS)疾病,常常导致严重的或永久性残疾。不仅给病人带来巨大的痛苦,也给社会和家庭带来沉重的负担。近年来,脊髓损伤的修复和治疗一直是世界研究的热点和难点,其主要原因是脊髓损伤后复杂的病理生理机制。脊髓损伤的病理生理过程主要包括原发性损伤和继发性损伤两个阶段。脊髓损伤后血管和神经组织机械性的破坏和断裂引起原发性损伤,继发性损伤主要涉及一系列复杂的分子级联事件,包括脊髓出血、水肿、细胞内外离子失衡、血管异常、缺血再灌注、脂质过氧化、线粒体功能障碍、谷氨酸兴奋性中毒和炎症反应等,最终导致神经细胞坏死或凋亡以及胶质瘢痕形成,阻碍轴突再生,进一步降低组织自我修复能力。其中炎症反应在脊髓继发性损伤中扮演了重要角色。脊髓损伤后血管的直接损害或炎症反应可导致血脊髓屏障(Blood spinal cord barrier, BSCB)受到破坏,BSCB的破坏又引起一系列渗透性的改变,包括脊髓出血、水肿和炎症反应,产生和分泌大量的毒性因子,启动氧化应激,导致组织水肿加重,严重影响患者预后。紧密连接(Tight junction, TJ)蛋白是维持BSCB功能最关键的结构之一,而基质金属蛋白酶-9(Matrix metalloproteinase-9, MMP-9)的表达与活性变化可能是导致细胞紧密连接蛋白分子元件异常变化及屏障破坏的一个重要机制。目前,临床上对SCI的治疗主要包括早期手术治疗(脊髓受压节段椎管减压术)、药物治疗(激素冲击疗法、脱水及神经营养药物等)以及后期的康复治疗。虽然这些治疗方法有一定的效果,但仍会遗留不同程度的神经功能障碍和残疾。因此,急需寻找一种新的治疗方法来促进神经再生和功能恢复。近年来干细胞移植治疗脊髓损伤被认为是一个潜在的治疗方法。多种类型的细胞,如胚胎干细胞、嗅鞘细胞、雪旺细胞、间充质细胞、神经干细胞和诱导多能干细胞,已被用于脊髓损伤治疗的研究。但目前为止适用于临床研究和开发的种子细胞依然较少,其主要问题为：细胞来源有限、细胞移植后存活率低、免疫排斥反应、伦理学问题、致瘤性等。因此,选择合适的种子细胞,提高移植细胞存活率以及深入了解移植细胞的作用机制对于脊髓损伤患者的治疗显得尤为重要。大量文献表明脂肪间充质干细胞(Adipose-derived mesenchymal stem cells, ADSCs)可以向多个胚层组织分化,在适当条件下可分化成脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、肌细胞以及神经细胞等。而且,与其他来源的干细胞相比,ADSCs具有组织来源广泛、易于获取和体外培养扩增等优点,逐渐成为近年来干细胞移植的种子细胞。大量研究表明,ADSCs移植可减少脊髓继发性损伤,促进运动功能的恢复。其机制可能与分泌神经营养因子、减轻炎症反应、减少细胞凋亡和胶质瘢痕的形成、促进内源性神经再生等有关。但是,关于ADSCs对脊髓损伤大鼠BSCB功能的影响及相关机制的研究尚未见报道。因此,本实验采用大鼠ADSCs移植来治疗大鼠脊髓损伤,探究其对BSCB功能的影响及其可能机制,为临床上脊髓损伤患者的治疗提供新的思路。方法：1、大鼠脂肪间充质干细胞(ADSCs)的收集、培养及流式细胞鉴定细胞表面标志。2、选取健康的成年雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat),采用钳夹法建立大鼠T10脊髓损伤模型。将造模成功的SD大鼠进行分组：假手术组、脊髓损伤组、细胞移植组。细胞移植组脊髓损伤后立即用Hamilton微量注射器将鉴定过的浓度为1×105/μ1的10μ1细胞沿损伤中心头尾端缓慢注入。脊髓损伤组在脊髓损伤后相同时间点相同部位注射等量的磷酸盐缓冲液(Phosphate buffer solution,PBS),假手术组仅行椎板切除,不损伤脊髓。3、行为学评定：术前3天及术后1、3、5、7、10、14天采用BBB(Basso-Beattie-Bresnahan, BBB)评定功能量表对所有大鼠后肢运动功能进行评分。4、脊髓组织含水量的检测：通过干湿重法对脊髓组织水肿进行检测。术后第1、3、5、7天大鼠麻醉后断头取脊髓,以损伤点为中心取出约1cm的脊髓组织进行水肿检测,使用电子天平称其湿重。将脊髓组织放入80℃烤箱内烘烤72 h后,再次用电子天平称其干重。脊髓组织含水量(%)=[(湿重-干重)/湿重]x 100%。5、血脊髓屏障通透性的测定：通过伊文思蓝对血脊髓屏障通透性进行检测。术后第3天将大鼠麻醉,股静脉注射2%伊文思蓝溶液(4 ml/kg),1h后用生理盐水行心脏灌注断头取脊髓。取损伤中心约1 cm的脊髓组织,称其湿重后加入2 ml 50%三氯乙酸,37℃孵育72h。充分研磨后14 000 r/min离心20 min。取1ml上清与3 ml无水乙醇混合。应用多功能酶标仪(参数设定：激发波长620nm、发射波长680 nm)测定荧光强度。由标准曲线得到各脊髓组织伊文思蓝含量,测得的结果用ug/g脊髓组织表示。6、Western blot检测蛋白表达变化术后第3天大鼠麻醉后快速断头取脊髓,取损伤中心约1 cm的脊髓组织。组织标本经匀浆、裂解、离心(12000 rpm,4℃,20 min)后,用蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度。裂解液依次经过电泳、转膜、一抗和二抗孵育、显影及定影。凝胶成像系统扫描并分析ZO-1、Claudin-5和MMP-9蛋白表达变化。7、脊髓组织石蜡切片制作及HE染色术后第3天大鼠麻醉后,分别用生理盐水和4%多聚甲醛溶液经心脏灌注。取损伤中心约1 cm的脊髓组织,4%多聚甲醛溶液浸泡12-24小时后,按照常规石蜡包埋方法制作成石蜡标本并切片,切片厚度为3 gm。组织切片经脱蜡、水化,苏木素染色2 min,盐酸酒精中分化数秒,伊红溶液染色30s后显微镜下观察、拍片、分析。8、TUNEL细胞凋亡检测。石蜡切片脱蜡和水化,柠檬酸缓冲液(PH=6.0)给予微波热修复,血清常温封闭30 min, PBS溶液冲洗后滴加10 μl TUNEL反应混合液,37℃避光孵育60min。荧光显微镜下观察、拍照。9、免疫荧光石蜡切片脱蜡和水化,柠檬酸缓冲液(PH=6.0)中给予微波热修复,血清室温封闭30 min后滴加一抗(兔抗MPO一抗、兔抗Iba-1一抗),4℃孵育过夜。PBS溶液冲洗后滴加相应的荧光二抗(山羊抗兔-Alexa Fluor 488),37℃避光孵育1h。荧光显微镜下观察、拍照。结果：1、细胞的生长、形态及鉴定：培养的脂肪间充质干细胞为圆形,大小不等,呈悬浮状,其间混有大量红细胞。静置培养24 h,可见细胞开始贴壁,48 h后贴壁细胞逐渐增多,细胞呈圆形或不规则多角形,随着时间延长贴壁细胞不断增多,细胞呈长梭形、有细小的突起。原代培养的细胞在1周左右融合达到80%-90%时可进行传代,此时细胞呈旋涡状或放射状排列。传代后细胞增殖速度很快,细胞纯度较高。流式细胞仪检测显示CD29和CD90高表达,分别为99.97%和99.04%,而CD45和CD49d低表达,分别为2.37%和2.67%,符合间充质干细胞表面标记物的一般表达情况。2、行为学评定：术前所有大鼠的BBB评分均为21分,除假手术组外,脊髓损伤组和细胞移植组的大鼠后肢运动功能在术后立即表现为完全性截瘫,BBB评分为0。随着时间延长,运动功能逐渐恢复,且同一时间点细胞移植组的BBB评分均高于脊髓损伤组。术后第5天开始,细胞移植组大鼠后肢运动功能恢复较脊髓损伤组明显,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。3、脊髓组织含水量测定假手术组脊髓组织含水量基本保持不变,脊髓损伤组和细胞移植组含水量在第3天时达到高峰,此后含水量逐渐下降。同一时间点脊髓损伤组含水量均高于细胞移植组,损伤后第7天两组脊髓组织含水量仍高于假手术组水平。造模后第1、3、5、7天,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。4、血脊髓屏障功能检测与假手术组相比,脊髓损伤后伊文思蓝的渗出量明显增加,提示脊髓损伤后BSCS通透性升高,而ADSCs移植可以缓解伊文思蓝的渗出量。三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。5、Western blot检测Western blot结果显示术后第3天MMP-9蛋白在假手术组少量表达,脊髓损伤后MMP-9表达明显升高,而进行干细胞移植可以明显抑制MMP-9的表达,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。ZO-1和Claudin-5的表达水平在假手术组最高,细胞移植组次之,脊髓损伤组最低,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。6、TUNEL细胞凋亡检测我们通过TUNEL试剂盒检测细胞凋亡的情况。发现假手术组细胞凋亡数最少,脊髓损伤组细胞凋亡数最多,而细胞移植组的细胞凋亡数显著低于脊髓损伤组,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。7、免疫荧光检测MPO的免疫荧光结果：假手术组基本未见阳性细胞表达,脊髓损伤组阳性细胞表达最多,细胞移植组阳性细胞表达明显低于脊髓损伤组,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。Iba-1的免疫荧光结果：假手术组小胶质细胞大部分处于静止状态,胞体小,有向各个方向的突起,呈分枝状。脊髓损伤后,小胶质细胞被激活,活化的小胶质细胞表现为突起回缩,胞体相对增大,但细胞移植组活化的小胶质细胞较脊髓损伤组少,三组之间两两相比差异均有统计学意义(P<0.05)。8、HE染色HE染色结果显示：假手术组脊髓组织中灰白质分界清楚,神经元形态结构正常,神经纤维排列紧密、连续,无出血、炎细胞浸润及空洞形成。脊髓损伤组和细胞移植组大鼠脊髓组织均发现不同程度的炎性细胞浸润、神经纤维溶解、脊髓空洞和出血灶,但细胞移植组炎性细胞浸润数目、神经纤维溶解的程度、脊髓空洞的面积和出血灶的大小均小于脊髓损伤组。结论：脂肪间充质干细胞移植促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的恢复,其机制可能通过抑制MPO的表达和小胶质细胞的活化,下调MMP-9,减少脊髓损伤后紧密连接蛋白ZO-1和Claudin-5的缺失,减轻脊髓水肿和减少细胞凋亡,从而减轻血脊髓屏障的破坏,发挥保护作用。