论文部分内容阅读
衰老(senescence)是机体的细胞、组织与器官在结构和功能上出现的不可逆退化和生理功能丧失,最终导致衰老相关疾病的发生。阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease,AD)是一种常见的年龄相关的神经退行性疾病,严重影响人类健康。脐带间充质干细胞(human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)具有自我更新和多向分化的潜能,能够修复受损组织,为AD等神经退行性疾病的治疗带来希望。但是,随着传代次数的增加,体外培养的h UC-MSCs逐渐呈现衰老细胞特征,表现为增殖分化能力变弱、干性降低,严重影响其治疗效果。因此,无论是在体内还是体外提高干细胞活性并延缓干细胞衰老是增强干细胞疗效的关键。MG53蛋白(Mitsugumin53 protein,MG53)是TRIM(Tripartite motif,TRIM)家族蛋白的一位成员,在细胞和组织损伤修复中发挥重要的作用。研究表明人源重组的MG53蛋白(Recombinant human MG53 protein,rh MG53)可以保护骨髓间充质干细胞抵抗低密度脂蛋白诱导的膜损伤,提高干细胞存活率。我们前期研究发现rh MG53可增强h UC-MSCs的抗氧化能力,增强干细胞对创伤性脑损伤的治疗效果。但是,在h UC-MSCs复制性衰老过程中,MG53能否延缓h UC-MSCs的衰老并提高干细胞移植对AD的神经保护作用尚未见报道。目的本课题首先以复制性衰老的h UC-MSCs为衰老模型,以MG53为突破口,通过体内外实验研究MG53蛋白对衰老的h UC-MSCs增殖、凋亡、周期、迁移、衰老和疗效的影响及其分子机制。其次,以AD小鼠为研究对象,探讨MG53蛋白联合h UC-MSCs移植对AD小鼠的治疗作用和分子机制。方法第一部分:MG53蛋白在体外和体内延缓h UC-MSCs的衰老(1)通过多次传代建立h UC-MSCs复制性衰老模型并给予MG53处理;CCK-8实验、Ed U染色实验、Transwell、流式细胞术分别检测MG53对h UC-MSCs细胞存活、增殖、迁移、凋亡和周期的影响;β-Gal染色实验、DAPI染色实验及免疫荧光实验检测MG53对h UC-MSCs衰老的表型的影响;氧化应激相关试剂盒检测MG53对衰老h UC-MSCs细胞氧化应激水平的影响;炎症因子芯片检测MG53对衰老h UC-MSCs细胞炎症因子释放的影响;Western blot和q RT-PCR检测MG53对h UC-MSCs细胞中衰老相关基因(P16、P21、P53、p CNA和Sirt1)表达的影响;Western blot检测Nrf2信号通路相关蛋白(Nrf2、SOD1、NQO1和Keap-1)表达的影响。(2)以AD小鼠为研究对象,随机分为APP~+组、P5 h UC-MSCs移植组(P5MSCs组)、P15h UC-MSCs移植组(P15 MSCs组)、MG53预处理的P15 h UC-MSCs移植(MG53-P15MSCs)组;采用Morris水迷宫和新事物识别实验检测小鼠学习记忆、认知能力;强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验评价四组AD鼠的焦虑抑郁情绪;Tunel染色、尼氏染色和免疫荧光检测移植后28天AD鼠脑内凋亡细胞数量、神经小体数量及成熟神经元数量变化。第二部分:MG53蛋白联合h UC-MSCs移植对阿尔茨海默鼠的神经保护作用(1)100只AD鼠随机分为APP~+组、MSCs组(MSCs移植治疗APP~+鼠)、MG53组(MG53移植治疗APP~+鼠)和MSCs+MG53组(MG53和MSCs联合治疗APP~+鼠);采用Morris水迷宫和新事物识别实验检测各组AD鼠的学习记忆、认知能力;强迫游泳实验、悬尾实验、旷场实验等评价四组AD鼠焦虑抑郁情绪的差异;利用Di I标记h UC-MSCs检测移植后3、7、14天检测MG53组和MSCs+MG53组脑内h UC-MSCs存活情况;MAB1281免疫荧光检测移植后3天h UC-MSCs存活情况;Tunel染色、尼氏染色检测移植后28天AD鼠脑内凋亡细胞数量、神经小体数量变化;免疫荧光和硫黄素S染色检测AD鼠炎症反应和Aβ沉积;SA-β-Gal染色检测AD鼠脑内衰老细胞数量;免疫荧光双标法检测AD鼠脑内神经再生;Western blot实验检测Tau蛋白磷酸化变化及Nrf2相关通路蛋白的表达变化。(2)采用Nrf2抑制剂鸦胆子苦醇(Brusatol,BRU)验证MG53联合h UC-MSCs是否通过激活Nrf2通路对AD鼠发挥神经保护作用。Morris水迷宫实验、旷场实验、强迫游泳实验、悬尾实验评价各组AD鼠认知能力的恢复、焦虑抑郁情绪的变化。尼氏染色实验、免疫荧光实验检测神经凋亡和神经再生。结果第一部分:MG53蛋白在体外和体内延缓h UC-MSCs的衰老1、随着h UC-MSCs传代次数的增加,h UC-MSCs增殖能力降低,周期阻滞、凋亡和衰老细胞增加、衰老相关异染色质聚集(SAHF)且细胞核增大,衰老相关基因表达增加。与未处理组相比,MG53蛋白预处理可以促进h UC-MSCs的增殖和迁移、减少G0/G1期阻滞并抑制细胞凋亡(P<0.05)。MG53可以降低SA-β-Gal阳性细胞数、减少SAHF的形成并增加Lamin B1的表达、显著降低P16、P21、P53、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β、IL-1?、IL-6的表达和分泌,并增加p CNA和Sirt1的表达和IL-10的释放(P_均<0.05),进而延缓h UC-MSCs的衰老。此外,MG53可以减少衰老h UC-MSCs中的ROS和MDA含量,增加SOD活力,降低细胞中氧化应激水平;Western blot结果显示MG53可以显著降低衰老h UC-MSCs中Keap-1的表达并促进核内Nrf2、NQO1和SOD1的表达(P<0.05)。2、与P15MSCs组相比,MG53预处理的P15MSCs移植组小鼠逃避潜伏期降低、穿越平台次数增加、平台所在象限时间停留显著增加、新物体辨别指数增加,差异有统计学意义(P<0.05)。强迫游泳实验、悬尾实验和旷场实验结果显示MG53预处理的P15 MSCs移植可以降低不动时间、增加APP~+小鼠的饲养次数和移动距离(P<0.05)。进一步研究显示与P15MSCs组相比,MG53-P15MSCs可以增加Neu N~+细胞数(P<0.05)并减少Tunel~+细胞数(P<0.05),进而促进AD鼠神经再生并减少神经细胞凋亡。第二部分:MG53蛋白联合h UC-MSCs移植对阿尔茨海默鼠的神经保护作用1、水迷宫、新事物识别实验、新奇抑制喂养实验和旷场实验显示,与APP~+组相比,MG53、MSCs或MG53+MSCs组小鼠的逃避潜伏期降低、平台穿越次数增加、平台所在象限停留时间增加、新物体辨别指数增加,进食潜伏期缩短且进食量增加,移动距离与直立次数增加,且联合治疗组效果最明显(P_均<0.05)。强迫游泳实验、悬尾实验和糖水偏好实验显示MG53、MSCs或MG53+MSCs治疗后APP~+小鼠的不动时间和漂浮静止时间明显比APP~+组减少,而糖水偏嗜度相对于APP~+组显著增加(P_均<0.05)。与APP~+组相比,MG53组、MSCs组和联合组海马CA1区中尼氏小体数量显著增多,而Tunel~+细胞数、GFAP~+细胞数、Iba-1~+细胞数明显减少,且联合组数量变化最明显(P<0.05)。此外,MG53联合h UC-MSCs移植可以显著降低血清中MDA含量并增加SOD活力(P<0.05),减少APP~+鼠脑内的β-Gal~+细胞数、Aβ斑块沉积数量和Tau蛋白磷酸化(P<0.05)。Di I染色和MAB1281免疫荧光结果显示MG53能够促进h UC-MSCs在APP~+鼠脑组织内存活和迁移(P<0.05)。与APP~+组相比,各治疗组Ed U/DCX、Ed U/Neu N和Ed U/Nestin阳性细胞数明显增加,且联合组阳性细胞数最多(P<0.05)。Western blot结果显示,与APP~+组相比,MG53组、MSCs组和MG53+MSCs组中Keap-1的表达降低,而核内Nrf2及NQO1、SOD1的表达水平明显升高,且联合组变化最显著(P<0.05)。但是,Nrf2质蛋白的表达在各组之间没有明显差异(P>0.05)。2、使用BRU抑制Nrf2通路,可以减弱MG53联合h UC-MSCs移植对APP~+鼠认知功能的促进作用,并降低联合移植对小鼠焦虑和抑郁情绪的改善效果(P<0.05)。BRU可以逆转MG53联合h UC-MSCs移植介导的尼氏小体增多,Aβ沉积减少和DCX表达增加(P<0.05),进而降低MG53联合干细胞h UC-MSCs移植对APP~+鼠的神经保护效果。结论1、MG53促进h UC-MSCs的增殖和迁移、抑制凋亡、延缓h UC-MSCs衰老并通过激活Nrf2信号通路降低衰老h UC-MSCs中的氧化应激水平。体内研究显示MG53预处理能提高P15 h UC-MSCs移植对APP~+小鼠的治疗效果。2、MG53能够激活Nrf2信号通路,增强h UC-MSCs移植对AD鼠的神经保护作用。