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研究背景多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种起源于淋巴浆细胞系的血液系统恶性肿瘤。其典型特征是浆细胞异常增殖,造成血钙增高、肾功能损害、贫血、骨病等临床表现。MM诊断的中位年龄为69岁、平均总生存期为6-7年。化学治疗是该病的主要治疗手段。近年来,随着对MM发病机制的深入探索,研究者们从分子水平筛选出蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂等靶向治疗药物,新药的出现使MM的治疗取得了突破。蛋白酶体抑制剂硼替佐米(bortemozib,Bor)的临床使用是MM化疗进程中的重大事件。硼替佐米不但可以直接抑制骨髓瘤细胞的增殖并诱导凋亡,同时还可以改善地塞米松等其他药物的化疗敏感性。以硼替佐米为基础的化疗方案短期内虽然明显改善了MM患者的相关症状并延迟了肿瘤进展,但是几乎所有使用硼替佐米的MM患者在用药一段时间后都会出现耐药特征,这极大限制了该药对于MM的长期疗效。截至目前,关于MM对硼替佐米的耐药机制研究尚少,其耐药机制尚不明确,临床也未出现有效的解决方案。Snail1是锌指转录因子Snail超家族成员,通常作为转录阻遏物。转录因子Snail1在控制上皮细胞向间质细胞转化和成纤维细胞活化中起着关键作用,其的表达和功能受到从基因转录到蛋白质修饰的多个水平的调节。Snail1在各种癌症中广泛表达,它的表达升高与癌症的发生、转移以及抗癌治疗中耐药的发生等密切相关。目前关于Snail1的研究主要集中在肝细胞癌、胃癌、膀胱癌等疾病,多发性骨髓瘤中尚未见报道。第一部分多发性骨髓瘤硼替佐米耐药机制产生过程中存在Snail1基因表达上调目的:明确MM硼替佐米耐药机制产生过程中存在Snail1基因表达的异常。方法:收集临床硼替佐米耐药MM患者耐药机制产生前后的多发性骨髓瘤细胞(multiple myeloma cells,MMCs)样本,分别提取总RNA和细胞总蛋白,荧光定量PCR(realtime-PCR)方法检测Snail1基因mRNA含量,免疫印迹方法(western blotting)检测Snail1蛋白表达,并分析其在两组样本中转录及蛋白表达差异。同时,采用Western blotting方法检测多药耐药基因1(multi-drug resistance gene 1,MDR1)以及抑癌基因P53(tumor protein p53,P53)mRNA含量及蛋白表达,分析两个功能基因在MMCs的硼替佐米耐药机制进展中的表达状况。结果:与硼替佐米化疗前的MMCs比较,发生硼替佐米耐药MMCs细胞中Snail1基因mRNA及蛋白表达均明显增强(P<0.01,vs化疗前MMCs);MDR1基因mRNA及蛋白表达均明显增强(P<0.01,vs化疗前MMCs);P53蛋白表达明显降低(P<0.01,vs化疗前MMCs),而mRNA含量无显著差异(P>0.05,vs化疗前MMCs);hsa-mi R-22-3p相对含量则明显增强(P<0.01,vs化疗前MMCs)。结论:Snail1基因在MMCs对硼替佐米耐药机制产生的过程中mRNA及蛋白表达均明显增强,其与MDR1基因mRNA及蛋白表达变化趋势一致,与P53蛋白的表达变化趋势相反,与hsa-mi R-22-3p相对含量变化趋势一致。第二部分Snail1沉默改善MMCs对硼替佐米耐药的作用机制分析目的:明确Snail1基因沉默改善硼替佐米耐药MMCs的化疗敏感性并阐明作用机制。方法:通过慢病毒途径在硼替佐米耐药MMCs细胞株XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor中沉默Snail1和P53,同时过表达MDR1,后分别提取总RNA和细胞总蛋白,Realtime-PCR、Western blotting方法分别检测三组mRNA、蛋白变化。生物信息学预测hsa-mi R-22-3p与P53基因3’非编码区(UTR)结合位点并通过荧光素酶报告基因实验证实。生物信息学预测核转录因子Snail1与hsa-mi R-22-3p和MDR1启动子的转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)并进行证实。通过慢病毒途径在XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞中沉默Snail1,后观察细胞耐药性、凋亡变化。基因干预后收集细胞总蛋白,Western blotting方法检测各组细胞MDR1和P53蛋白表达变化。实验中设置MDR1和P53回复对照组,对Snail1/MDR1和Snail1/hsa-mi R-22-3p/P53作用途径的主导性做出评价。结果:通过慢病毒途径可以在XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞中有效沉默Snail1和P53,有效过表达MDR1基因(P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组)。Hsa-mi R-22-3p通过与P53基因3’UTR区种子区“5’-GGCAGCU-3’”的结合抑制P53蛋白表达。Snail1在MDR1和hsa-mi R-22-3p启动子区域均存在TFBS结合位点,并对二者转录进行正向调控。Snail1沉默可以有效降低耐药细胞株XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor对硼替佐米的IC50值(P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组)。在XG-7/Bor细胞中,Snail1基因沉默可以有效上调细胞凋亡率(P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组),抑制MDR1蛋白表达并上调P53蛋白表达(P<0.01,vs细胞对照组或者NC对照组),外源MDR1基因过表达或者P53基因沉默能够明显抑制Snail1基因沉默对其表达影响(P<0.01,vs Snail1基因沉默组)。结论:慢病毒途径是解决和提高MMCs基因转导效率的有效方法。Snail1基因沉默通过Snail1/MDR1作用途径有效改善XG-7/Bor和RPMI-8226/Bor细胞对硼替佐米的耐药,并通过Snail1/hsa-mi R-22-3p/P53作用途径诱导细胞凋亡。