脑卒中是全球威胁人类健康的重大疾病之一,是目前首要的致残和仅次于癌症和心血管疾病的第三大致死性疾病。流行病学显示,脑卒中发病呈年轻化和逐年递增的趋势。脑卒中根据病因的不同主要分为缺血性和出血性脑卒中,其中缺血性脑卒中占87%。研究揭示影响脑卒中发生、发展的主要病理机制包括能量代谢障碍、神经元的过度去极化、兴奋性毒性损伤、离子稳态失衡、炎症与免疫障碍、凋亡及自噬等。控制脑卒中病死率并提高生存质量是当前医学研究亟待解决的难题。目前美国FDA批准用于治疗缺血性脑卒中的仅有重组组织型纤维蛋白酶原激活剂(r-tPA)一种药物。但严格的治疗时间窗及易诱发脑出血等并发症极大地限制了其临床的广泛应用,脑卒中的药物研发任重道远。血小板活化因子(platelet activating factor,PAF)是一种内源性活性磷酸介质,与花生四烯酸代谢密切相关,具有广泛的生物活性。在机体发生变态反应和炎性反应过程中,血小板活化因子由巨噬细胞、内皮细胞、血小板、多形核细胞等多种参与反应的细胞或组织产生,广泛的参与到相应的病理生理过程中。血小板活化因子的特异性的受体是PAFR(platelet activating factor receptor,PAFR)。缺血性脑卒中的过程中,异常释放的PAF与其受体PAFR结合后,可通过以下机制造成脑损伤:(1)增加神经细胞内钙离子浓度,扰乱细胞膜功能,对神经元造成直接损伤;(2)促进血小板聚集和激活,释放血管活性物质,引起血管栓塞等,加重脑水肿;(3)趋化和激活炎性细胞,促进炎性因子的释放,启动和加重炎性损伤等。大量动物实验和临床试验表明,急性脑梗死患者血浆和脑梗死模型鼠脑组织中PAF含量显著升高。但其激活的途径并不清楚。MicroRNA(miRNA,即微小RNA),一类非蛋白编码的RNA家族,在体内的主要功能是调控目标基因的表达。MicroRNA是通过与特定mRNA结合或者通过调节特定mRNA的蛋白质翻译过程发挥相应的功能。目前人类基因组中已确认的miRNA有一千多种,可能参与调控人类30%蛋白编码基因的表达。miRNA通过调节靶基因的表达在细胞中行使重要的功能,与胚胎的发育,生长发育、细胞的增殖、分化密切相关。在人类基因组序列中,miRNA-98为一种MicroRNA,序列为 5’-UGAGGUAGUAAGUUGUAUUGUU-3’(GeneBank:GeneID:407054)。miRNA-98在进化上高度保守,不同物种间存在同源性。在动物或人身上有相似的作用。综上,本研究推测,miRNA可以通过调节血小板激活因子受体的表达,影响血小板激活因子的下游信号通路,进而参与到缺血性脑卒中的损伤过程中。为了探讨该作用及相关机制,我们进行如下的研究。实验分为两个部分。第一部分miRNA-98和PAFR相关性研究目的:研究miRNA-98和血小板活化因子受体PAFR的表达相关性。在缺血性脑卒中病人血清中miRNA-98的表达情况和血小板活化因子的表达情况。方法:构建一个质粒,将要检测的转录因子表达质粒与报告基因质粒共转染HEK293T,研究miRNA-98和PAFR的相关性。搜集脑卒中病人患者的血清,并抽取同一地区的性别及年龄与病例组相匹配的个体作为健康对照组。对两组研究对象抽取血液,分别使用Real-time PCR进行miRNA-98的表达,使用Elisa法进行血小板活化因子的检测。结果:构建的hsa-miR-98-5p对PTAFR WT&Mut表达的影响。由于hsa-miR-98-5p mimics与含PTAFR基因3’UTR片段的双荧光素酶报告基因共转染验证试验相对于负对照(mimic control与含PTAFR基因3’UTR片段的双荧光素酶报告基因共转染试验)有显著性差异(p值为0.001),荧光比值为负对照的65.8%。hsa-miR-98-5p mimics对含PTAFR-3’UTR预测作用位点的基因表达水平有抑制作用,但预测作用位点突变后抑制作用明显减弱。因此,hsa-miR-98-5p很可能通过PAFR起作用。脑卒中患者血清中PAF505.7±93.6pg/ml,而健康人群对照组的含量为163±36.6pg/ml,两者相比,脑卒中患者血清中PAF升高3.4倍。脑卒中患者组的血清中miRNA-98的含量为0.23±0.07,而健康对照人群的含量为0.92±0.18。与健康对照组相比,脑卒中患者血清中miRNA-98显著降低。结论:离体研究表明miRNA-98能与PAFR的启动子区结合。miRNA-98能影响PAFR的表达水平升高。临床研究表明,缺血性脑卒中患者中血清PAF含量显著升高,miRNA-98含量明显降低。第二部分:miRNA-98及PAFR相关信号通路的研究目的:研究在大鼠缺血模型上,半影区miRNA-98和PAFR的表达及相关性,并其与下游NF-kB,MAPK家族及细胞凋亡等信号通路的关系。方法:制备大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型。使用Real-time PCR进行大鼠模型血清和脑组织半影区miRNA-98的表达的检测。使用蛋白免疫印迹法测定大鼠模型血清和脑组织半影区PAFR的表达量。观察两者相关性。使用蛋白免疫印迹法测定大鼠模型血清和脑组织半影区PAFR下游NF-kB,MAPK家族及细胞凋亡等信号通路的关系的表达。结果:与假手术组大鼠相比,缺血性脑卒中大鼠血清及半影区miRNA-98的表达显著降低。模型组的半影区中PAFR蛋白表达为1.72±0.06pg/ml,而假手术组的表达为1.00±0.14pg/ml。与假手术组相比,脑卒中大鼠缺血半影区PAFR表达上升,两者有显著性的差异。与假手术组相比,模型组pIKKβ表达显著升高,同时P65活化水平也显著上升。在缺血半影区,JNK和P38的磷酸化水平增高。PAFR下游细胞凋亡信号通路中,Bcl-2蛋白表达显著下调,Bax表达则明显升高。凋亡执行蛋白caspase-3在半影区表达也显著升高结论:在体研究表明miRNA-98能与PAFR的启动子区结合。在脑组织缺血损伤的半影区,miRNA-98表达水平降低,使PAFR的表达水平升高。在体研究PAFR下游信号通路变化情况,模型组IKKβ、P65、JNK和P38的磷酸化水平增高。Bcl-2蛋白表达显著下调,Bax和caspase-3表达则明显升高。