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目的:建立银杏叶制剂的HPLC指纹图谱,对不同厂家银杏叶制剂指纹特征相比较;建立高效液相色谱法测定银杏叶制剂中4种黄酮类成分的含量,为银杏叶制剂的质量评价提供有效手段和依据。
方法:
1.银杏叶制剂指纹图谱研究
(1)提取:比较了不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择提取成分较多,提取率较高的提取条件。
(2)色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,调节柱温,选择最佳的色谱条件,使色谱图符合指纹图谱研究的要求。
(3)系统适用性试验:在已确定的色谱条件下,考察指纹图谱中参照物芦丁峰的分离度和理论板数。
(4)精密度试验:取同一份供试品溶液,重复进样6次,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。
(5)重复性试验:取同一批银杏叶制剂6份,平行制备供试品溶液,分别进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。
(6)稳定性试验:取同一份供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进样,记录保留时间和峰面积,同时比较所得指纹图谱的相似度。
(7)指纹图谱的建立:分别取不同厂家的银杏叶制剂22批进行指纹图谱分析。
2.银杏叶制剂化学成分含量测定研究
(1)提取:比较了不同提取方法、提取溶剂及提取时间的提取效果,选择待测成分提取率较高的提取条件。
(2)色谱条件:选用合适的色谱柱,调整流动相的组成、配比、流速,使各待测成分色谱峰的分离度均符合测定的要求。
(3)标准曲线的制备:配制一系列浓度的混合对照品溶液,测定峰面积;以峰面积为纵坐标,以浓度为横坐标,绘制标准曲线,经回归处理得各标准曲线方程。
(4)检测限试验:将混合对照品溶液逐步稀释,当信噪比S/N≥3时确定为检测限。
(5)精密度试验:取同一份样品溶液,重复进样6次,测定峰面积,计算仪器精密度;
(6)重复性试验:取同一样品,精密称取6份,制备溶液,进样测定。
(7)稳定性试验:取样品溶液分别于0、2、4、6、8、24h进样测定。
(8)回收率试验:取已知含量的银杏制剂6份,精密称定,分别精密加入一定量的对照品,制备供试品溶液,进样测定回收率。
(9)样品测定:在上述色谱条件下,测定不同厂家银杏叶制剂中各待测成分的含量。
结果:
1.银杏叶制剂指纹图谱研究
(1)提取:最佳提取条件为用75%甲醇超声提取30min。
(2)色谱条件:采用C18色谱柱;乙腈-0.05%磷酸为流动相进行梯度洗脱,流速为1mL·min-1,柱温为30"C,进样量为10μl。
(3)系统适用性试验:按芦丁峰计算理论板数约为4700,与其它色谱峰的分离度大于1.5。
(4)精密度试验:以芦丁峰为内参比峰,计算各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积,其RSD分别为0.08%~0.89%和1.1%~2.0%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.97,符合指纹图谱测定要求,精密度良好。
(5)重复性试验:各主要色谱峰相对保留时间和占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积均无明显变化,其RSD分别为0.10%~0.81%和1.0%~1.5%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.98,符合指纹图谱测定要求,重复性良好。
(6)稳定性试验:各主要色谱峰相对保留时间及占总峰面积5%以上色谱峰的相对峰面积均无明显变化,其RSD分别为0.11%~1.1%和1.2%~1.8%,同时所得指纹图谱相似度均高于0.98,符合指纹图谱测定要求,稳定性良好。
(7)指纹图谱的建立:得到不同来源银杏叶制剂的指纹图谱。
2.银杏叶制剂化学成分含量测定
(1)提取:同“指纹图谱”。
(2)色谱条件:同“指纹图谱”。
(3)标准曲线的制备:各待测组分线性关系良好,r>0.99。
(4)检测限试验:1-4的检测限分别为0.015、0.011、0.023、0.017μg·ml-1。
(5)精密度试验:方法的精密度良好,其仪器RSD小于3%。
(6)重复性试验:6份样品的平均含量分别为2.194、0.1788、0.1358、0.1056mg/片,RSD分别为1.1%、1.2%、2.4%、2.2%,方法的重复性好。
(7)稳定性试验:供试品溶液在24h内基本稳定,1-4的RSD分别为0.77%、1.0%、1.7%、1.8%。
(8)回收率试验:平均回收率在97%~99%之间,RSD均小于3%,方法的准确度高。
(9)依据上述色谱条件进行分析,由标准曲线计算得到各个样品中各待测组分的含量。
结论:本文建立了不同厂家银杏叶制剂的HPLC-UV指纹图谱,并进行了比较,利用相似度软件对不同厂家银杏叶制剂间的差异进行了研究;首次建立了高效液相色谱法同时测定银杏叶制剂中4种黄酮类成分的含量。方法简便快速、结果准确可靠,专属性强,精密度和稳定性良好,可用于银杏叶制剂的质量控制。