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细胞死亡是多细胞生物生命过程中重要的生理或病理现象,也是恶性肿瘤治疗的细胞学响应基础,可分为凋亡(Apoptosis)、坏死(Necrosis)、自吞噬(Autophagy)和有丝分裂灾变死亡(Mitotic catastrophe),其中有丝分裂灾变死亡是发生在细胞有丝分裂期由于异常的细胞分裂而导致的死亡,它常常伴随着细胞周期检测点的异常或纺锤体结构的损伤而发生。有丝分裂灾变死亡的揭示为恶性肿瘤治疗、特别是对传统化疗药物有耐药性的肿瘤的治疗开辟了新的途径,因而也成为开发新的抗癌药物的分子靶向目标。DNA-PKcs是DNA依赖蛋白激酶的催化亚单位(DNA Dependent Protein Kinase Catalytic Subunit),与Ku70和Ku80共同构成DNA-PK复合物。主要功能是参与DNA双链断裂的非同源末端连接(NHEJ)和V(D)J重组,维持染色体端粒末端结构稳定性。DNA-PKcs具有丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶活性,可磷酸化多种癌基因产物和转录因子(如c-fos、c-myc、oct-1、c-jun)、DNA损伤修复反应蛋白(如H2AX、p53、Chk2、Artemis、XRCC4),表明DNA-PKcs是一种具有多种功能的蛋白。近年来有研究表明,DNA-PKcs在人类多种肿瘤组织中异常高表达,并且与癌组织恶性度、耐辐射、预后差有密切关系。通过免疫组化分析显示90 %的肝癌患者的肿瘤组织中的DNA-PKcs蛋白水平呈强阳性,而正常肝组织中DNA-PKcs蛋白表达水平呈弱阳性,因此DNA-PKcs是一个很有价值的抗癌分子靶标。我们实验室前期从香兰素衍生物中发现DNA-PKcs的有效抑制剂BVAN08,并发现该化合物对多种组织来源的癌细胞都有杀伤效应,表明BVAN08是一种很有开发前景的抗肿瘤药物。本论文在前期研究结果的启示下,对BVAN08作为分子靶向抗肿瘤药物进行更深入研究,取得了如下主要进展:1)采用MTT法、台盼蓝染色法、Annexin V/PI染色法以及荧光染色法检测BVAN08对细胞增殖活性以及细胞凋亡的影响,发现BVAN08对HepG2细胞的生长有明显的抑制作用,并诱发细胞凋亡;通过单细胞电泳、脉冲电泳检测BVAN08对DNA损伤的影响,发现BVAN08可诱发HepG2细胞DNA双链断裂,且损伤程度与BVAN08作用时间呈正相关;通过流式细胞术检测BVAN08对细胞有丝分裂进程的影响以及激光共聚焦显微镜检测细胞纺锤体结构的变化,发现BVAN08诱发长时间的细胞有丝分裂中期阻滞,并且出现巨大细胞以及有丝分裂异常细胞,证实BVAN08诱发HepG2细胞有丝分裂灾变死亡;Western blot方法检测DNA损伤检测点相关蛋白的表达变化,发现BVAN08抑制DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs以及G2/M期转换调控因子FoxM1蛋白的表达,激活检测点激酶Chk2蛋白。2)为了进一步研究BVAN08是通过何种信号调节通路导致细胞发生有丝分裂灾变死亡,以及是否与凋亡存在联系等,通过基因芯片技术以及蛋白质组学技术来研究有丝分裂灾变死亡的发生机制。鉴定出BVAN08作用后诱导表达上调的基因有CDKN1A,CCNE1,CDKN1C,CDKN2D,表达下调的基因有CDC2。蛋白质组学研究结果筛选到93个差异蛋白点(匹配137个肽段),其中表达上调的蛋白点有45个(匹配76个肽段),表达下调的蛋白点有48个(匹配61个肽段)。BVAN08作用后显著相关差异蛋白主要集中在14-3-3调节信号通路、PI3K/AKT信号通路、细胞骨架信号通路等,暗示这些通路参与细胞有丝分裂灾变死亡。3)为了研究DNA-PKcs与细胞有丝分裂灾变死亡的关系,采用RNA干扰手段构建DNA-PKcs的siRNA载体,筛选出DNA-PKcs蛋白表达抑制的肝癌细胞模型,并且比较三种化疗药物(DRB、DDP、VP16)对DNA-PKcs表达抑制的HepG2-H1细胞的影响。发现三种药物均能抑制HepG2-H1细胞生长,导致细胞周期紊乱,其中DRB是诱发G2-M期细胞阻滞,VP-16诱发S期阻滞。DNA-PKcs缺陷显著改变了HepG2细胞对上述药物的细胞周期变化反应性,其中显著加强了DDP诱发HepG2细胞的S阻滞,推动了VP-16诱发S期阻滞细胞进入G2-M。三种药物处理后HepG2-H1细胞都出现异常有丝分裂现象,多核细胞数目也明显增多,表现出有丝分裂灾变死亡的特征,表明DNA-PKcs在调控细胞有丝分裂过程中也发挥功能,BVAN08诱发的有丝分裂灾变死亡与抑制细胞中DNA-PKcs蛋白表达有关。4)通过建立表达绿色荧光蛋白的HepG2细胞系,并利用活体成像系统检测荷瘤鼠体内肿瘤的生长情况,研究发现BVAN08可抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长,对荷瘤鼠体重以及外周血白细胞无明显的毒性作用。免疫组化实验显示BVAN08治疗组肿瘤组织中DNA-PKcs表达水平低于对照组,表明BVAN08具有荷瘤鼠体内的抗肿瘤活性,抑制肿瘤生长作用与降低组织中DNA-PKcs表达有关,与离体细胞学结果一致。5)研究BVAN08的辐射增敏效应以及对肿瘤的放疗效果,发现BVAN08与射线联合作用更加显著的抑制细胞存活,提高肿瘤细胞对射线的敏感性,BVAN08与射线联合作用显著抑制荷瘤鼠肿瘤的生长,表明BVAN08提高荷瘤鼠体内肿瘤的辐射增敏效应,并且对荷瘤鼠心、肝、肾无明显的毒性作用。6)研究BVAN08对细胞DNA损伤修复的影响,以及Western blot检测细胞DNA损伤修复蛋白DNA-PKcs、ATM、检测点激酶Chk2、G2期检测点的关键蛋白Plk1。结果发现BAN08抑制照射诱发的DNA双链断裂损伤的修复,抑制损伤修复蛋白DNA-PKcs的表达,揭示BVAN08通过激活ATM、Chk2通号通路提高细胞辐射敏感性。本课题提供了多方面证据表明BVAN08可以诱发细胞有丝分裂灾变死亡,可以抑制荷瘤鼠体内肿瘤生长,并且对正常组织毒性作用弱,本研究还揭示了DNA-PKcs在有丝分裂灾变死亡过程中以及提高荷瘤鼠辐射敏感性中的作用,也为DNA-PKcs作为抗肿瘤药物研发的一个有效分子靶标提供了有力的实验数据。综合结果表明,BVAN08具有开发成为一种有效的辐射增敏抗癌药物的价值。