第一部分:iPSCs条件培养基促进B-CECs生长的研究目的:评估iPSCs条件培养液(iPSCs-derived conditioned medium,iPSCs-CM)对B-CECs生长的作用。方法:利用0.22μm的过滤器滤过后-80℃冷冻储存的方法收集已经使用过的iPSCs培养基,按一定比例添加收集的培养基到普通内皮细胞培养基(corneal endothelial medium,CEM)中培养B-CECs即为实验组,未添加的为对照组。通过CCK-8,流式细胞仪检测细胞周期、细胞凋亡情况,活细胞计数及Western blot对磷酸化的Akt蛋白表达量的检测验证条件培养基对于角膜内皮细胞增殖活性的影响;通过PCR,免疫荧光染色,划痕实验,荧光素钠渗透实验(fluorescein leakage test,FLT)探讨条件培养基对角膜内皮细胞标志蛋白基因表达的影响及对内皮细胞功能的影响;最后通过ELISA对条件培养基有效成分进行分析。结果:25%iPSCs-CM是培养B-CECs的最佳浓度。细胞培养到第4代实验组形态仍维持均一六角形,而对照组内皮细胞不规则增大失去六边形结构。免疫荧光染色示B-CECs在iPSCs-CM和CEM中均可表达ZO-1,Na+/K+-ATPase。定量分析Ki67,Na+/K+-ATPase,Col4A,Col8A基因表达,实验组细胞较对照组细胞基因表达量明显上调(P<0.05,n=3)。同时,细胞周期检测示,进入S期和G2期细胞比率实验组较对照组高,用流式细胞仪检测培养4代的B-CECs凋亡细胞较对照组少,差异有统计学意义(P<0.05,n=3)。在划痕实验及荧光素钠渗透实验中,同对照组比较,实验组细胞移行效率更高且在传4代过后具有更好的屏障功能。机理分析发现,经饥饿处理后的细胞,在添加实验组培养基后磷酸化的Akt持续高表达到180min,而对照组表达量则逐渐减少。这一发现表明,iPSCs-CM可能通过上调PI 3-kinase信号通路调节细胞周期,是iPSCs-CM促进B-CECs细胞增殖的机制之一。条件培养液有效成分分析发现,Actvin A表达量在实验组明显升高,培养基添加Actvin A后,可使B-CEC细胞形态维持跟条件培养基相类似的六边形形态。结论:iPSCs-CM可有效促进B-CECs增殖同时保持内皮细胞的功能,Actvin A是其促进细胞增殖、维持细胞形态的有效成分之一,其促增殖的机理与磷酸化的Akt持续高表达有关。第二部分:transwell接触共培养促进单散ipscs细胞生长及分化目的:观察transwell接触共培养促进单散细胞人诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)生长及分化的作用。方法:将1-2代牛角膜内皮细胞(bovinecornealendothelialcells,b-cecs)接种在transwell小室底面培养8h后,应用accutase酶消化及40μm过滤处理获得ipscs单散细胞,将其接种到已有cecs的transwell小室内共培养14d,前3d使用mtesr1培养基,第4d开始用含10%胎牛血清的低糖dmem培养基。分别进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,pcr)、免疫荧光、死活细胞染色及碱性磷酸酶(alkalinephosphatase,ap)染色,对ipscs多能特性表达及分化进行鉴定。设定ipscs单散细胞共培养组为实验组,常规培养ipscs组为对照组一,非共培养ipscs单散细胞组为对照组二。结果:培养b-cecs形态呈典型的六边形铺路石样外观,人ipscs呈克隆样生长,共培养3d后ipscs贴壁呈单散细胞生长,免疫荧光检测未分化标志nanog和oct4呈阳性,qpcr检测nanog、oct4、sox2基因表达实验组与对照组一比较差异无统计学意义(p>0.05,n=3)。死活细胞染色实验组死细胞明显减少,与对照组二比较差异有统计学意义(p<0.001,n=3)。共培养14d后,人ipscs细胞形态比较均一,呈多边形,体积增大,无明显克隆团块。ap染色阴性,免疫荧光染色cd31表达阳性,cd34和cd133表达阴性。结论:与b-cecs共培养可增强人单散细胞ipscs活性,使ipscs形态上向内皮样细胞转化,表达部分角膜内皮细胞标志。transwell接触共培养模型可以促进单散细胞ipscs生长及分化。第三部分:ipscs诱导分化为角膜内皮样细胞的实验研究目的:观察transwell接触共培养联合小分子诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcells,ipscs)分化为角膜内皮样细胞的作用。方法:在transwell条件下建立b-cecs与ipscs接触共培养体系(具体方法同第一部分),生物模拟角膜内皮胚胎发育前后过程序贯添加小分子发育诱导剂,首先诱导ipscs分化为神经嵴样细胞(1μmgsk3βinhibitorvi+10μmsb431542)10d,进而诱导神经嵴样细胞分化为内皮祖细胞(1μmgsk3βinhibitorvi+1μmra+5ng/mltgf-β2)4d,最后诱导内皮祖细胞分化为内皮样细胞(1μmgsk3βinhibitorvi+5ng/mltgf-β2+1μmy-27632)7d。诱导结束后进行倒置显微镜观察,拍照记录细胞形态变化,pcr、免疫荧光、碱性磷酸酶(alkalinephosphatase AP)染色检测相关标志基因及蛋白表达情况,最后对诱导后细胞进行扫描电镜(scanning electron microscope SEM)观察其形态的显微变化。设定iPSCs共培养诱导分化组为实验组,常规培养iPSCs组为对照组。结果:经过10d的神经嵴诱导后,iPSCs细胞体积明显增大,形态拉长呈长梭形。经过4d的内皮祖细胞诱导,细胞形态缩短,逐渐变圆,呈不规则形,免疫荧光染色内皮祖细胞标志Pitx2表达阳性,RT-PCR电泳条带诱导后细胞Pixt2呈阳性表达,而对照组表达阴性。最后经过7d的内皮样细胞诱导,细胞形态逐渐均一,呈较典型的六边形铺路石样外观,无明显克隆团块,扫描电镜可见细胞单层分布,体积饱满,胞浆丰富,形态规则,表面大量微绒毛,突触连接紧密;AP染色阴性,而对照组可见大量克隆团样生长细胞,AP染色阳性;免疫荧光染色内皮标志AQP1、ZO-1、Na+/K+-ATPase表达阳性,而对照组除ZO-1呈弱阳性表达外其余均表达阴性;qPCR检测Nanog、Oct4、Sox2基因表达实验组与对照组比较表达量明显减少,差异有统计学意义(P<0.001,n=3)。结论:利用transwell与B-CECs接触式共培养同时序贯添加小分子诱导剂,iPSCs可逐步诱导分化为角膜内皮样细胞,表达部分角膜内皮细胞标志。生物模拟角膜内皮细胞发育可促进iPSCs向角膜内皮样细胞分化。