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研究背景:癫痫脑组织P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)过表达是耐药性癫痫(drug-resistant epilepsy,DRE)发生的主要机制之一。探索调控癫痫脑内P-gp过表达的机制成为目前癫痫领域的研究热点之一。孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)是一种含有配体结合域和DNA结合域的转录因子,能够调控异生物质解毒系统中关键基因的表达,参与机体对异生物质的清除、代谢和转运。已有研究证实PXR介导的药物与药物间的相互作用影响癌症、HIV等疾病的药物疗效,尤其在肿瘤化疗中,一些化疗药物作为PXR配体诱导肿瘤细胞药物转运体和药物代谢酶的表达,导致肿瘤耐药性的产生。抑制PXR表达能否调控癫痫发作诱导的血脑屏障上P-gp表达和功能,目前尚不清楚。研究发现,癫痫发作时,细胞外升高的谷氨酸可活化环氧合酶-2,激活炎性反应的关键因子核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)信号通路,从而上调血脑屏障上内皮细胞P-gp表达。我们课题组前期在体研究发现:海人酸致痫大鼠脑内P-gp过表达受NF-κB的调控,进一步研究发现PXR在慢性癫痫大鼠脑组织表达增加,抑制PXR活性能下调慢性癫痫脑内P-gp表达。PXR和NF-κB是否共同参与调控癫痫发作诱导的血脑屏障上内皮细胞P-gp表达和功能,目前对此尚无报道。细胞外逐渐升高的谷氨酸水平是不同病因癫痫共同的病理特征,本研究通过体外实验,探索抑制PXR/NF-κB表达对谷氨酸处理模拟癫痫发作环境下小鼠脑微血管内皮bEnd.3细胞P-gp表达和功能的影响,为研究癫痫发作诱导P-gp过表达的调控机制提供理论依据。第一部分下调PXR表达对谷氨酸诱导的小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达和功能的影响目的:探索下调PXR表达对谷氨酸处理模拟癫痫发作环境下小鼠脑微血管内皮株bEnd.3细胞P-gp表达和功能的影响。方法:体外培养bEnd.3细胞,分为不同浓度谷氨酸处理组(以0、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmo1/L谷氨酸处理细胞30 min)、谷氨酸不同时间处理组(以100 μmol/L谷氨酸处理细胞0、15 min、30 min);使用小干扰RNA(siRNA)抑制PXR表达,分为对照siRNA(NC siRNA)+谷氨酸组、PXR siRNA+谷氨酸组。蛋白免疫印迹检测细胞PXR和P-gp蛋白表达,实时定量PCR检测细胞P-gp mRNA表达,细胞免疫荧光法检测细胞核内PXR蛋白表达,采用P-gp探针底物罗丹明123(Rh123)细胞蓄积实验检测P-gp外排功能。结果:0 μmol/L(对照组)、10μmol/L、50μmol/L、100 μmol/L 谷氨酸处理组PXR 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.20、1.05±0.12、1.43±0.16、1.62±0.12,P-gp蛋白相对表达量分别为1.00±0.24、1.04±0.26、1.50±0.11、2.15±0.10,与对照组相比,50 μmol/L和100 μmol/L谷氨酸组PXR和P-gp蛋白表达均增高(P<0.05),尤以100μmol/L组PXR和P-gp蛋白表达最明显。100 μmol/L谷氨酸处理0 min(对照组)、15 min、30 min组PXR蛋白相对表达量分别为1.00±0.14、1.37±0.17、1.80±0.19,P-gp 蛋白相对表达量分别为 1.00±0.14、1.20±0.06、2.18±0.24,与对照组相比,15 min和30 min组PXR蛋白表达均增加(P<0.05);30 min组P-gp蛋白表达增加(P<0.05)。细胞免疫荧光结果显示bEnd.3细胞核PXR蛋白表达随谷氨酸处理时间的延长而逐渐增加。谷氨酸处理组细胞核PXR蛋白表达(1.43±0.22 vs 1.00±0.09)高于对照组(t=-3.11,P= 0.04)。与 NC siRNA+谷氨酸组相比,PXR siRNA+谷氨酸组PXR蛋白表达下调了 37%(1.00±0.00 vs 0.63±0.18;t 3.41,P=0.02),P-gp蛋白表达下调了 43%(1.00±0.00vs 0.57±0.09;t=7.94,P=0.00),P-gp mRNA 表达下调了 52%(1.00±0.04 vs 0.48±0.08;t=10.98,P=0.00)。谷氨酸组细胞内Rh123荧光强度(0.72±0.01 vs 1.00±0.03)较对照组降低(t=9.66,P=0.00);谷氨酸+维拉帕米(P-gp抑制剂)组(1.07±0.04)较谷氨酸组增高(t=-11.93,P=0.00);PXR siRNA+谷氨酸组(0.91±0.03)较 NC siRNA+谷氨酸组增高(0.69±0.05;t=-7.52,P=0.00)。结论:下调PXR表达能够抑制谷氨酸处理模拟癫痫发作环境下的小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达及其功能,提示PXR参与调控癫痫发作诱导血脑屏障P-gp表达及其功能。第二部分抑制PXR/NF-κB对谷氨酸诱导的小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达和功能的影响目的:探讨抑制PXR/NF-κB对谷氨酸模拟癫痫发作环境下的小鼠脑微血管内皮细胞P-gp表达和功能的影响。方法:体外培养bEnd.3细胞株,分为对照组(给予正常细胞培养基)、谷氨酸组(100μmol/L谷氨酸处理细胞30 min)。使用分别针对PXR、NF-κB p65基因的siRNA抑制PXR/NF-κB表达,分为NC siRNA+谷氨酸组、PXR siRNA+谷氨酸组、NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组、PXR siRNA+NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组。蛋白免疫印迹检测细胞PXR、NF-κB p65、P-gp蛋白表达水平,Rh123细胞蓄积实验检测细胞P-gp功能。结果:与对照组比较,谷氨酸组细胞核内NF-κB p65表达增加(1.01±0.07 vs2.14±0.18;t=-10.37,P=0.00)。PXR siRNA+谷氨酸组 PXR、P-gp 蛋白表达均低于NC siRNA+谷氨酸组,差异均有统计学意义(t=13.76,P=0.00;t=7.77,P=0.00);NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组 NF-κB p65、P-gp 蛋白表达均低于 NC siRNA+谷氨酸组,差异均有统计学意义(t=10.76,P=0.00;t=7.25,P=0.00);PXR siRNA+NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组 PXR、NF-κB p65、P-gp 表达均低于NC siRNA+谷氨酸组,差异均有统计学意义(t=15.84,P=0.00;t=10.84,P=0.00;t=10.60,P=0.00);PXR siRNA+NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组P-gp蛋白表达均分别低于PXR siRNA+谷氨酸组、NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组,差异均有统计学意义(t=2.83,P=0.02;t=3.35,P=0.01);PXR siRNA+谷氨酸组 NF-κB p65蛋白表达(0.83±0.09)低于NC siRNA+谷氨酸组,差异有统计学意义(t=2.52,P=0.04);NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组 PXR 蛋白表达(0.49±0.04)低于 NC siRNA+谷氨酸组,差异有统计学意义(t=15.66,P=0.00)。与NC siRNA+谷氨酸组细胞Rh123荧光强度相比,PXR siRNA+谷氨酸组(1.34±0.13 vs 1.00±0.00)、NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组(1.50±0.11 vs 1.00±0.00)、PXR siRNA+NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组(1.90±0.10 vs 1.00±0.00)均增高,差异均有统计学意义(t=-4.11,P=0.00;t=-6.11,P=0.00;t=-10.91,P=0.00);PXR siRNA+NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组分别高于PXR siRNA+谷氨酸组、NF-κB p65 siRNA+谷氨酸组,差异均有统计学意义(t=-6.81,P=0.00;t=-4.80,P=0.00)。结论:PXR和NF-κB p65共同参与调控癫痫发作诱导脑血管内皮细胞P-gp表达及其功能。