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本课题组在2004年5月,从中国东海北起上海崇明岛南至福建南麂列岛离岸35海里的区域采集了28个海水、海泥样本,利用稀释涂平板法从中分离得到1043株微生物样本,并利用稻瘟霉模型作为活性初筛模型,得到216株对稻瘟霉具有较强抑制活性的菌株。本文随机选取了30株稻瘟霉活性菌株用抗大肠杆菌模型进行复筛得到活性菌株F81612,该菌株对大肠杆菌的生长表现出很强的抑制活性。
通过抽提细菌总DNA模板,PCR扩增16S rDNA序列,Blast比对并构建进化树,结果显示F81612与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的进化位置最为接近,它们的相似性高达99％。细菌革兰染色、芽孢染色、培养特征、部分生化反应的研究也显示该菌具备枯草芽孢杆菌的基本特性,因此鉴定其为枯草芽孢杆菌。从细菌在各盐浓度下生长曲线可以看出菌株F81612是一种中等嗜盐菌,最适生长盐度为10％。
利用Placket-Burman法和响应曲面法对菌株的发酵条件进行摸索,以提高单位体积活性物质的产量,并通过统计学方法分析确定最大产活条件为：温度29.9℃、初始pH值6.0、装液量52.3％、振荡频率130 r/min、接种量10％、培养时间7 d;培养基配方：蛋白胨4 g、酵母提取物10 g,牛肉膏0.4 g,葡萄糖10 g,人工海水1000 mL。
小量发酵后发酵液依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等体积充分萃取,分别测定对大肠杆菌的活性,结果发现活性成分分布在乙酸乙酯萃取部分中,为中等极性物质。摇瓶大规模发酵得菌液60 L,离心除菌体后,上清用等体积乙酸乙酯充分萃取三次,减压蒸干,最后得到乙酸乙酯浸膏24.6 g。对乙酸乙酯浸膏经反复凝胶柱层析及反相硅胶柱层析,然后以水-甲醇/乙腈洗脱系统经HPLC纯化制备,共得到了25个化合物,利用核磁共振和质谱等技术并结合化合物理化性质确定了其中12个化合物的结构,它们分别为:Macrolactin A, Maerolactin S,3-羟基乙酰基吲哚,3-吲哚乙醇,环(色-脯)二肽,环(异亮-色)二肽,环(亮-脯)二肽,环(亮-缬)二肽,环(异亮-脯)二肽,环(苯丙-缬)二肽,N-苯乙基乙酰胺,对羟基苯甲醛。
化合物活性测定Macrolactin A对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为0.45μg/mI,和6.3μg/mL,Macrolactin S对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的MIC值分别为0.2μg/mL和0.7μg/mL,两者都能强烈抑制稻瘟霉孢子萌发,MIC值分别为3.6μg/mL和2.2μg/mL,但抗肿瘤活性不明显。其余化合物抗菌抗肿瘤活性均不明显。已确定化合物的结构如图：
综上所述,本工作主要针对海洋枯草芽孢杆菌F81612及其生物活性物质进行研究,分离发现了Macrolactin类大环内酯,为新型抗菌药物的研发提供了先导化合物,并且为深入开发东海微生物药用微生物资源奠定了一定的工作基础。