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类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis,RA)最主要的病理改变是滑膜炎,以滑膜细胞凋亡减少、肿瘤样生长及炎性介质大量分泌为特征,继而导致关节软骨破坏及骨侵蚀,最终导致关节的不可逆破坏从而致残。成纤维样滑膜细胞(fibroblast-like synoviocyte,FLS)是关节滑膜的重要组成部分,是上述病理过程的重要参与者。RA-FLS的激活与多条信号通路有关,其中最为经典的信号通路便是NF-κB信号通路。在RA-FLS中,NF-κB通路被明显激活后其下游靶基因(如cIAP1、cIAP2、IL-1,IL-6)的表达增加使得RA-FLS抗凋亡能力以及炎症因子、粘附分子、基质降解酶的分泌能力明显升高。除了NF-κB信号通路外,Wnt信号通路在RA中的作用也是近年来研究的热点,有证据显示Wnt信号通路在RA中也处于激活状态,参与了RA-FLS的活化。巢乱蛋白(Dishevelled,Dvl)是处在Wnt信号通路中游的关键的信号蛋白分子,是非常重要而有趣的分子。Dvl有三种的同型异构体(Dvl1,DVL2,Dvl3)和4个高度保守结构域(DIX域、PDZ域、DEP域以及DSV)。Dvl不仅是经典和非经典Wnt通路的分线器,也可以与其他信号通路上的几十种蛋白相互作用,所以也是Wnt通路与BMP、mTOR等多条信号通路的交汇点。尽管在肿瘤中已经有一些关于Dvl蛋白的研究,但是目前在RA中还没有关于Dvl蛋白表达及功能的相关研究。因此,本研究着重探讨了DVL2在RA滑膜组织和RA-FLS中的表达情况以及其对RA-FLS凋亡和炎症因子分泌的影响和相关分子机制。一、DVL2在类风湿关节炎滑膜组织及RA-FLS中处于高表达状态首先,我们与关节外科合作,获取了RA、骨关节炎(osteoarthritis,OA)及正常创伤(Trauma)患者的滑膜组织,通过免疫组织化学(IHC)、蛋白质印记(WB)等方法检测了DVL2蛋白的表达情况。结果发现尽管DVL2蛋白的表达在RA与OA中没有显著差异,但是RA滑膜组织中的DVL2蛋白表达量明显高于Trauma患者,提示DVL2可能通过Wnt通路参与RA滑膜的增殖。另外,从滑膜组织中提取原代FLS后进行检测,结果同样显示DVL2在RA-FLS中的表达高于Trauma-FLS。滑膜组织的IHC和RA-FLS的免疫荧光检测结果显示DVL2在FLS的细胞质和细胞核中均有表达。二、DVL2在体内可促进RA-FLS凋亡并抑制其炎症因子的分泌在明确了DVL2在RA滑膜组织和RA-FLS中呈高表达状态后,为了对其功能做进一步的研究,我们建立了胶原诱导关节炎大鼠(CIA)模型,并构建了人源DVL2慢病毒过表达质粒(lv-dvl2),包装成慢病毒后注入cia大鼠膝关节中。待dvl2过表达后观察大鼠膝关节滑膜、软骨、及软骨下骨的变化,并对关节滑膜细胞凋亡及炎症因子分泌情况进行检测。有趣的是,dvl2在cia大鼠膝关节中过表达后非但没有使滑膜增殖进一步加重,反而一定程度上抑制了滑膜炎并对关节起到了一定的保护作用。对大鼠的关节滑膜和全膝关节进行病理检查发现dvl2可以减轻cia大鼠滑膜炎;通过对大鼠膝关节腔内的关节液进行elisa检测发现dvl2可减少cia大鼠膝关节内il-1β、il-6及il-8的分泌;micro-ct检测结果显示dvl2可以减轻cia大鼠软骨下骨的破坏;但是番红o-固绿染色并未观察到dvl2可以明显减轻cia大鼠关节软骨破坏。进一步的tunel检测结果显示dvl2可以明显增加cia大鼠膝关节滑膜的凋亡,提示dvl2除了可能参与ra滑膜的增殖以外,还可以在体内调控滑膜细胞的凋亡。三、dvl2在体外也可促进ra-fls凋亡并抑制其炎症因子的分泌为了进一步研究dvl2在ra中的功能及可能的作用机制,我们提取了人源的ra-fls细胞并在其中过表达了dvl2基因,然后进行高通量mrna测序,结果发现nf-κb通路及tnf通路都出现了明显的下调。因此,我们将dvl2在ra-fls中过表达后观察其对ra-fls细胞活性、凋亡、周期以及炎症因子分泌的影响。结果发现在体外过表达dvl2的ra-fls细胞活性明显下降,在加入tnf-α刺激后这一现象更为明显;进一步对ra-fls的凋亡及细胞周期进行检测,结果发现dvl2可以明显增加ra-fls凋亡率并对细胞周期造成一定的影响;用elisa方法对细胞上清进行检测发现,dvl2可减少ra-fls分泌的il-1β、il-6及il-8;而这一抑制作用也在加入tnf-α刺激后同样变得更为明显。提示dvl2在炎性环境下可以抵消一部分炎症反应,从而一定程度上遏制ra-fls的无限增殖。四、dvl2通过抑制nf-κb通路影响ra-fls凋亡和炎症因子的分泌结合上述结果,我们推测dvl2可以抑制ra-fls的增殖及炎症因子的分泌很有可能是通过抑制nf-κb通路进而抑制其调控基因实现的。因此,我们首先通过rt-pcr对mrna测序所得的差异基因进行验证,结果发现dvl2在ra-fls中过表达后可以抑制抗凋亡基因a20、gadd45β、和ciap2的表达,而对ciap1的表达却没有明显的影响;当给予tnf-α刺激后再次对其进行了检测,rt-pcr结果显示DVL2对A20、cIAP1和cIAP2的表达起到显著的抑制作用,但对GADD45β的表达却没有明显的影响;DVL2在RA-FLS细胞中过表达后IL-6基因表达明显下调,而IL-1β及IL-8的基因表达却没有明显变化;给予TNF-α刺激后DVL2则可明显抑制RA-FLS中IL-1β、IL-6以及IL-8基因的表达。因为上述抗凋亡基因和炎症因子基因均可被NF-κB通路调控,所以我们推断DVL2是通过抑制NF-κB通路实现上述功能的。那么DVL2是如何抑制NF-κB通路的呢?首先我们通过Flowsight检测发现DVL2在RA-FLS中可以抑制P65的入核;通过IP检测发现DVL2在RA-FLS中也可以与P65相互作用,通过ChIP检测发现DVL2与P65相互作用后可以抑制P65与上述靶基因启动子的结合,从而减少抗凋亡基因和炎症因子基因的表达。综上所述,本研究从临床滑膜标本的采集到原代细胞的培养,从体内动物实验到体外细胞实验再到基因层次的改造,全面系统的研究了DVL2在RA患者关节滑膜原代细胞中的表达情况以及DVL2在体内体外对RA-FLS增殖及炎症因子分泌的影响。除了观察现象我们还利用m RNA-seq、IP、Flowsight、ChIP等方法对DVL2的作用机制进行了深入研究。发现虽然DVL2在RA滑膜中处于高表达状态,可能参与了滑膜的肿瘤样生长,但是DVL2也可以促进RA-FLS凋亡并抑制其炎症因子的分泌。而DVL2之所以能发挥这种双刃剑样的作用,主要是其一方面是Wnt信号通路中重要的正向调控蛋白,另一方面DVL2还可以通过影响P65的入核及其与下游调控基因启动子的结合来抑制NF-κB通路。DVL2多重功能的发现对于理解Wnt和NF-κB通路这两条重要的信号通路在RA中的功能对话提供了重要信息,同时也为理解RA的发生发展以及寻找新的治疗靶点提供了思路。