【摘 要】
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研究背景和目的:甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的肿瘤,发病率连年攀升,尽管甲状腺癌在长期生存方面预后良好,但PTC仍有相当高的复发率,晚期PTC中转移性复发的诊断和治疗仍然是一个挑战。基于分子机制的研究有望帮助诊断和治疗PTC。因此,探讨PTC的分子病理机成为甲状腺癌诊断和治疗领域十分重要的问题。m~6A甲基化是一种常见的真核生物RNA表观遗传修饰,影响m RNA稳定性、剪接、输出和翻译来调节m R
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研究背景和目的:甲状腺癌是内分泌肿瘤中最常见的肿瘤,发病率连年攀升,尽管甲状腺癌在长期生存方面预后良好,但PTC仍有相当高的复发率,晚期PTC中转移性复发的诊断和治疗仍然是一个挑战。基于分子机制的研究有望帮助诊断和治疗PTC。因此,探讨PTC的分子病理机成为甲状腺癌诊断和治疗领域十分重要的问题。m~6A甲基化是一种常见的真核生物RNA表观遗传修饰,影响m RNA稳定性、剪接、输出和翻译来调节m RNA动力学,不仅参与调控编码RNAs,也可以修饰长链非编码RNA。该修饰过程是使RNA中腺嘌呤（A）碱基的第6位N元素甲基化,与可以识别RNA上m~6A甲基化位点的“甲基化识别酶”YTH家族蛋白1/2/3、胰岛素样生长因子2 m RNA结合蛋白1/2/3和常见的“甲基转移酶”如:甲基转移酶样因子3、RNA结合基序蛋白15等形成的甲基转移酶复合体的催化相关;该过程已经在多篇文章中被报道称与肿瘤的发展预后和治疗相关,而ZC3H13（含有锌指CCCH结构域蛋白13）是负责m~6A安装的m~6A"writer",与RNA代谢和胚胎干细胞更新有关。ZC3H13在多种肿瘤中发挥着重要的作用,影响肿瘤的发展和诊疗,但是其在甲状腺癌中的作用还未明确。本研究首先通过WB测定了甲状腺癌细胞中ZC3H13的表达水平,并且通过体外实验探索ZC3H13对甲状腺癌细胞增殖侵袭能力的影响。其次通过生物信息学分析,我们发现IQGAP1 m RNA上存在多个m~6A甲基化位点,并且通过体外实验进一步验证ZC3H13与IQGAP1 m RNA的关系以及ZC3H13通过IQGAP1 m RNA对甲状腺癌细胞的增殖的影响。最终明确ZC3H13调控IQGAP1m RNA的具体机制。本研究为甲状腺癌的诊断和新型药物靶点提供了新的研究思路。方法:1、临床水平蛋白印迹法检测ZC3H13、IQGAP1及其他相关蛋白表达情况;q RT-PCR检测ZC3H13、IQGAP1的m RNA水平。2、细胞水平分别使用CCK-8测定法、跨井迁移法和侵袭测定法测定甲状腺癌细胞增殖、迁移和侵袭能力变化。3、动物水平建立体内裸鼠异种移植瘤模型,通过LV-NC,LV-ZC3H13,LV-ZC3H13+si-YTHDF2三组体内验证ZC3H13过表达通过降低IQGAP1对肿瘤生长的抑制作用。4、分子水平首先使用Me RIP q PCR评估IQGAP1 m RNA的m6A水平,其次在放线菌素D（一种RNA聚合酶抑制剂）存在下观察到ZC3H13对IQGAP1 m RNA稳定性的影响,通过RIP分析探讨YTHDF2和IQGAP1 m RNA之间的相互作用。5、生物信息学UALCAN和GEPIA网络资源在线分析ZC3H13的表达情况,使用UALCAN研究ZC3H13表达与临床病理的关系。结果:1、ZC3H13在PTC细胞系BCPAP、KTC-1、k1、HTH83和TPC-1中的表达降低。2、ZC3H13的过表达抑制PTC细胞的增殖、侵袭和迁移,而敲除ZC3H13增强了PTC细胞的增殖、侵袭和迁移能力。3、ZC3H13过表达抑制了IQGAP1的表达,但ZC3H13敲除增强了IQGAP的表达。在ZC3H13过表达的PTC细胞中,IQGAP1 m RNA的m6A水平升高,IQGAP1 m RNA的表达随着放线菌酮D处理时间的增加而降低。YTHDF2比Ig G富集了更多的IQGAP1 m RNA,并且YTHDF2的敲除逆转了ZC3H13过表达对IQGAP1 m RNA稳定性的影响。4、ZC3H13的过表达抑制了肿瘤生长,而IQGAP1的过表达可以逆转ZC3H13过表达对肿瘤生长的抑制作用。结论:1、ZC3H13在PTC中低表达2、ZC3H13抑制KTC-1和TPC-1细胞的增殖、侵袭和迁移,反之ZC3H13的敲除促进BCPAP和TPC-1细胞的增殖、侵袭和迁移3、ZC3H13通过m~6A修饰调节IQGAP1 m RNA的稳定性4.、ZC3H13过表达通过降低IQGAP1表达水平从而对肿瘤生长的抑制作用
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