MiRNAs是由20-25个核苷酸组成的内源性非编码小分子RNA,从1993年Anbros等人在线虫中发现第一个microRNA分子lin-4以来,miRNA的功能机制就引起了人们极大的重视。MiRNAs参与多种重要的生物进程,包括细胞发育、分化、细胞周期调节、细胞凋亡等生理过程以及心血管疾病、神经系统疾病、糖尿病、肿瘤等病理过程。据预测miRNA能够调控近30%人类基因的表达,多项研究显示miRNAs可以与靶基因mRNA非翻译区和编码区靶位点完全或不完全互补结合,在转录后水平降解靶mRNA或抑制靶mRNA的翻译。近期有文献报道miRNAs通过复合体形式结合靶基因的启动子区域,在转录水平下调基因的表达,另外,有研究数据发现miRNAs能够直接或间接的在转录水平和翻译水平活化基因的表达。上述研究结果提示miRNAs可能通过不同的作用机理调控下游靶基因的表达进而影响细胞重要的生物学进程。MiR let-7首次在秀丽隐杆线虫中作为一个异时性开关基因被发现,主要在线虫发育的后期转录合成,作为编码21个核苷酸的RNA分子,通过互补结合异时性基因lin-14、lin-28、lin-42和daf-12等的3’非翻译区调控靶基因的表达。MiR let-7a是miR let-7家族的一员,研究表明miR let-7a在肿瘤发生发展过程中发挥重要的调控作用。miR let-7a在肺癌、乳腺癌、前列腺癌、大肠癌等多种肿瘤组织中表达降低,且其表达降低与肿瘤发生及不良预后密切相关。在肿瘤细胞中高表达miR let-7a可以显著抑制细胞增殖、侵袭、体内成瘤及转移。研究认为miR let-7a主要通过调控下游靶基因的表达发挥肿瘤抑制作用。文献报道的miRlet-7a下游靶基因主要有K-RAS、HMGA2、EZH2、c-myc等。近年来miR let-7a抗肿瘤作用研究取得很大进展,但是miR let-7a发挥肿瘤抑制作用的机制尚未完全阐明。发现鉴定miR let-7a未知的靶基因,研究其与靶基因的作用方式,对明确miR let-7a的抑癌机制,分析与miR let-7a相关的肿瘤发生发展以及探索针对miR let-7a途径的肿瘤治疗策略至关重要。我们前期在前列腺癌细胞系LNCaP中分别转染miR let-7a mimics和inhibitor,然后通过基因芯片检测miR let-7a诱导的LNCaP细胞基因表达谱的改变,分析筛选差异表达基因,结果发现：miR let-7a表达或活性改变引起众多基因的表达发生改变,其中泛素特异性蛋白酶35(ubiquitin specific peptidase 35, USP35)变化最为显著。USP35是新近鉴定的去泛素化酶,具有特异性识别靶蛋白,介导蛋白去泛素化的作用。目前对USP35的认识和有关该基因的研究报道甚少。已有的研究主要发现：1)USP35过表达可以抑制PARK2介导的线粒体自噬；2)以阵列为基础的比较基因组杂交显示乳腺癌组织中USP35基因拷贝数出现变异；3)高频辐射可以显著升高USP35的表达。USP35在肿瘤发生发展中的作用、作用机制及临床意义等均未见文献报道。本研究首先在多种肿瘤细胞及临床肿瘤组织标本中检测miR let-7a和USP35表达的相关性,验证确定USP35是miR let-7a新的靶基因,miR let-7a可以正向调控USP35的表达。同时通过细胞功能学实验证明USP35介导miR let-7a对肿瘤细胞增殖的抑制作用。接着,我们研究了USP35对肿瘤细胞增殖的调控作用,实验结果显示过表达USP35显著抑制肿瘤细胞的增殖,而干扰USP35在肿瘤细胞中的表达,可以明显促进细胞增殖。裸鼠体内成瘤实验证实USP35可以抑制肿瘤细胞体内成瘤能力。除此之外,本研究还对USP35可能作用的靶底物进行了初步地筛选鉴定。通过免疫共沉淀结合质谱分析筛选到了与USP35相互作用的蛋白ABIN-2,并证实USP35能通过去泛素化作用稳定ABIN-2,进而增强ABIN-2对NF-κB信号通路的抑制作用。总之,本研究主要集中探讨了miR let-7a上调USP35的表达及USP35对肿瘤细胞增殖的调控作用及可能的分子机制,我们的实验结果阐明了USP35在肿瘤中的生物学功能,提供了miR let-7a-USP35-ABIN-2这样一条新的肿瘤调控通路,借助本次研究可以寻找肿瘤疾病潜在的治疗靶点,帮助我们控制人类肿瘤的发展进程。第一部分MiR let-7a对USP35的正向调控作用研究[目的]在不同肿瘤细胞系和临床肿瘤组织标本中研究miR let-7a与USP35表达的关系,进一步验证芯片结果,明确miR let-7a对USP35的调控作用。[方法]1. qRT-PCR和Western blot检测LNCaP细胞株中转染miR let-7a mimics和inhibitor后USP35的表达。2. qRT-PCR检测miR let-7a在多种肿瘤细胞及对应正常上皮细胞中的表达,Western blot检测USP35在上述细胞中的表达。3.选择USP35高表达的HeLa细胞及USP35低表达的H1299细胞,分别转染miR let-7a mimics和inhibitor, Western blot检测USP35的表达。4. qRT-PCR和Western blot检测1niR let-7a和USP35在肺癌和乳腺癌组织标本及癌旁组织标本中的表达,并分析miR let-7a表达和USP35表达的相关性。5.在LNCaP细胞中转染miR let-7a mimics和对照control mimics,24h后分别共转染USP35干扰及其对照质粒,MTT和克隆形成实验检测细胞增殖的变化。[结果]1. qRT-PCR和Western blot结果显示miR let-7a mimics明显升高USP35 mRNA水平和蛋白水平,而miR let-7a inhibitor明显下调了USP35 mRNA水平和蛋白水平。2. qRT-PCR结果显示,与正常组织细胞相比,miR let-7a在多种肿瘤细胞中表达降低；Western blot结果显示,与niR let-7a表达趋势一致,USP35在大多数肿瘤细胞中的表达亦明显降低。3. Western blot结果显示,miR let-7a mimics显著升高H1299细胞中USP35蛋白水平,而miR let-7a inhibitor降低HeLa细胞中USP35蛋白水平。4. qRT-PCR结果显示,与癌旁组织相比,]miR let-7a在多数肺癌和乳腺癌组织中表达降低；Western blot结果显示,与癌旁组织相比,USP35在肿瘤组织中的表达明显降低,相关性分析表明乳腺癌组织标本中的miR let-7aUSP35呈现正相关。5.MTT和细胞克隆形成实验结果显示,miR let-7a mimics]能抑制肿瘤细胞增殖和克隆形成,干扰LNCaP细胞中USP35的表达后miR let-7a mimics抑制细胞增殖的效果减弱。[结论]1. miRlet-7a可以正向调控USP35的表达。2.USP35介导miR let-7a抑制肿瘤细胞增殖的作用。第二部分USP35抑制肿瘤增殖作用的研究[目的]通过体外细胞实验和裸鼠体内模型实验检测USP35是否具有抑制肿瘤细胞增殖的作用。[方法]1.构建USP35表达质粒pcDNA3.1-USP35,瞬时转染LNCaP和H1299细胞,48h后,Western blot检测USP35的表达。2.在LNCaP和HeLa细胞中,瞬时转染USP35干扰质粒(sh-USP35-K sh-USP35-2、sh-USP35-3、sh-USP35-4)及其对照质粒sh-CTL, Western blot检测USP35的表达,确定沉默效果最佳的干扰质粒。3.在LNCaP和H1299细胞中分别转染USP35表达质粒,在LNCaP和HeLa细胞中分别转染USP35干扰质粒,MTT法检测USP35变化对不同肿瘤细胞增殖的影响。4.在LNCaP和H1299细胞中分别转染USP35表达质粒,在LNCaP和HeLa细胞中分别转染USP35干扰质粒,克隆形成实验检测USP35变化对不同肿瘤细胞克隆形成能力的影响。5.应用高表达USP35及其空白对照的H1299细胞建立裸鼠异种移植瘤模型,观察肿瘤体积、重量情况,研究上调USP35表达对裸鼠体内成瘤的影响。[结果]1.成功构建USP35表达及干扰质粒,Western blot验证结果显示USP35表达和干扰效果明显。2.MTT检测结果显示,与对照组相比,过表达USP35显著抑制H1299和INCaP细胞的增殖,干扰USP35明显促进HeLa和LNCaP细胞的增殖。3.克隆形成实验结果表明,过表达USP35显著抑制H1299和LNCaP细胞形成的克隆数,干扰USP35导致HeLa口LNCaP细胞形成克隆数增加。4.裸鼠体内成瘤实验表明,过表达USP35显著抑制肿瘤细胞体内成瘤能力。[结论]USP35能够抑制肿瘤细胞增殖,在肿瘤发生发展过程中可能作为一个抑癌基因发挥作用。第三部分USP35通过去泛素化ABIN-2抑制NF-kB信号通路的作用研究[目的]USP35作为泛素特异性蛋白酶家族的成员,能催化去除底物上的泛素,但其具体作用的靶底物尚未有文献报道,本部分主要对其作用的靶底物及可能的分子机制进行初步探讨。[方法]1.USP35表达及对照质粒分别与HA标签的泛素表达质粒共转染H1299和LNCaP细胞,免疫共沉淀检测USP35对细胞内蛋白泛素化水平的影响。2.USP35表达及对照质粒分别转染H1299细胞,应用免疫共沉淀结合质谱分析,筛选与USP35相互作用的蛋白。3.构建与USP35相互作用蛋白ABIN-2表达质粒Flag-ABIN-2, USP35表达质粒单独或与Flag-ABIN-2共转染HEK293T和H1299细胞,免疫共沉淀验证二者的相互作用。4.提取LNCaP和HeLa细胞总蛋白,免疫共沉淀检测内源性USP35和ABIN-2的相互作用。5. Flag-ABIN-2, HA标签的泛素表达质粒与USP35表达质粒或对照质粒共转染H1299细胞,免疫共沉淀检测USP35对ABIN-2泛素化水平的影响。6.USP35表达及对照质粒分别转染H1299细胞,USP35干扰及对照质粒分别转染LNCaP细胞,蛋白合成抑制剂放线菌酮(cycloheximide, CHX,50μg/mL)分别作用上述细胞0,2,4,8,12,24h,Western blot检测USP35对ABIN-2蛋白半衰期的影响。7.USP35表达及对照质粒分别转染H1299细胞,USP35干扰及对照质粒分别转染LNCaP细胞,蛋白酶体抑制剂MG132 (10μM)作用细胞6h, Western blot检测ABIN-2蛋白的变化。8. Western blot检测上述肺癌和乳腺癌组织标本中USP35和ABIN-2的表达,并分析USP35表达和ABIN-2表达的相关性。9. NF-kB依赖的荧光素酶报告基因质粒分别与USP35表达或对照质粒共转染H1299和：LNCaP细胞,收集细胞前TNF-a (2ng/mL)分别刺激上述细胞6h,双荧光素酶活性检测USP35对TNF-a诱导的NF-kB信号通路的影响。10. NF-kB依赖的荧光素酶报告基因质粒分别与USP35干扰或对照质粒共转染HeLa和LNCaP细胞,并在USP35干扰组细胞中回补ABIN-2的表达,收集细胞前TNF-a(2ng/mL)分别刺激上述细胞6h,双荧光素酶活性检测上述细胞中NF-kB信号通路的变化。[结果]1.免疫共沉淀结果显示USP35可以显著降低LNCaP和H1299细胞总蛋白的泛素化水平。2.免疫共沉淀结合质谱分析结果显示,ABIN-2是USP35相互作用的蛋白之一。3.免疫共沉淀结果表明,USP35和ABIN-2在体外存在相互作用。4.免疫共沉淀结果表明,内源的USP35和ABIN-2能相互结合。5.免疫共沉淀实验显示USP35显著降低H1299细胞中ABIN-2的泛素化水平。6.CHX示踪结果表明,过表达USP35能延长ABIN-2的半衰期,干扰USP35的表达明显缩短ABIN-2的半衰期。7.蛋白酶体抑制实验结果显示,蛋白酶体抑制剂MG132能够阻断过表达USP35诱导的ABIN-2蛋白含量的增加及沉默USP35导致的ABIN-2蛋白含量的降低,提示USP35通过蛋白酶体途径抑制ABIN-2的降解。8. Western blot结果显示,与癌旁组织相比,ABIN-2在肺癌和乳腺癌组织中的表达显著降低,相关性分析显示USP35表达与ABIN-2的表达呈显著正相关。9.双荧光素酶活性检测实验结果显示在LNCaP和H1299细胞中过表达USP35后可以明显抑制TNF-a诱导的NF-kB活性。10.双荧光素酶活性检测实验结果显示在LNCaP和HeLa细胞中干扰USP35表达后能明显增强TNF-a诱导的NF-kB活性,共转染ABIN-2能导致增强的NF-kB活性降低。[结论]1.USP35通过去泛素化ABIN-2,减少其蛋白酶体途径的降解,从而上调ABIN-2的表达。2.USP35通过稳定ABIN-2蛋白抑制TNF-a诱导的NF-kB活性。