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假单胞菌属是环境中一类常见的细菌,其降解环境污染物的范围广泛,在环境生物修复方面起着重要作用。多环芳烃是一类难降解有机环境污染物,可以在食物链中富集,具有致癌、致畸、致突变的“三致”效应。假单胞菌在多环芳烃的生物降解中扮演重要角色。本实验室前期在汕头污染海域海底表层沉积物中分离到的一株施氏假单胞菌JP1(Pseudomonas stutzeri JP1),并发现菌株JP1具有降解多环芳烃的能力,但是菌株在低氧条件下对多环芳烃的降解机制还尚不清晰,本研究针对上述问题开展研究,取得以下主要结果: 首先,通过一系列生理生化试验,发现菌株JP1为革兰氏阴性菌,能够产生过氧化氢酶,具有较好的耐盐性,在有氧和低氧的条件下均能生长。菌株JP1对氯霉素和链霉素具有抗性;菌株JP1对抗生素羧苄青霉素敏感。 其次,发现菌株JP1在有氧和低氧条件下均可以利用多种多环芳烃作为唯一碳源和能源生长。有氧条件下,培养24h,菌株JP1对终浓度20mg/L的萘、菲、芘的降解率分别是92.89%、50.83%、42.50%;低氧条件下,培养24h,菌株JP1对终浓度20mg/L的萘、菲、芘的降解率分别是95.26%、33.23%、37.35%。 第三,利用RNA-Seq技术,对菌株JP1在不同培养条件下的样本进行转录组分析。经测序获得的总读长(Total Reads)为110,468,508 bp,总核酸(Total Nucleotides)为12,929,366,300nt,利用软件Trinity做转录组从头组装,组装得到3900个基因,G+C含量为64.61%,共注释到3820个基因,基因的平均长度为899.43bp。对不同处理样本的差异表达基因进行分析以及GO功能显著性富集分析和pathway显著性富集分析,发现大量与多环芳烃降解相关的基因,其中包括甲基巴豆酰基-CoA羧化酶和乙醇脱氢酶,这两个酶在萘、菲、芘的诱导下均呈现上调表达。利用RT-qPCR验证甲基巴豆酰基-CoA羧化酶α、β、γ亚单位分别上调表达2.85、5.74和1.26倍。说明甲基巴豆酰基-CoA羧化酶参与低氧条件下多环芳烃的降解。 第四,为了进一步研究菌株JP1低氧条件下多环芳烃降解相关蛋白,利用二维电泳技术分离多环芳烃菲诱导下的差异蛋白。利用软件PDQuest8.0分析差异点,从中筛选6个差异显著的蛋白点,用MALDI-TOF-TOF质谱分析鉴定差异蛋白,鉴定结果为:超氧化物歧化酶、3-α-甲醇胺脱水酶、醌蛋白乙醇脱氢酶和ABC转运绑定蛋白,还有一个延伸因子和一个假定蛋白。用RT-qPCR验证醌蛋白乙醇脱氢酶在菲的诱导下上调表达3.16倍,进一步证实其参与多环芳烃的低氧降解。 通过上述研究,初步解析了菌株生理生化特性及其对不同多环芳烃的降解效果;从转录和蛋白质水平初步探索了其在低氧条件下降解多环芳烃的机制。本研究将对利用功能微生物进行多环芳烃污染环境的治理提供理论依据和技术支持。