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研究背景骨肉瘤是最常见的恶性骨肿瘤,约占原发性恶性骨肿瘤的40%,为原发髓内高度恶性的肿瘤,预后极差,致死率、致残率高,给无数患者和家庭带来极大痛苦和沉重的经济负担。传统的骨肉瘤治疗方式包括术前大剂量化疗、根治性骨肉瘤切除术和术后大剂量化疗三部分,但传统治疗方案副作用明显,为达到病灶局部药物浓度需加大全身化疗剂量,导致骨髓抑制、肝肾功能损害、中枢神经系统损害等致命性副作用。因此,传统给药方式不仅没能有效延长患者生存年限,反而使患者生活质量急剧下降,临床工作中迫切需要一种全身副作用小并且局部疗效确切的新型给药方式解决这一难题。20世纪80年代Klemm发明庆大霉素珠链,是由聚甲基丙烯酸甲酯复合物制成的含有庆大霉素的珠链式载药内植物,将其放置在炎症部位,缓慢地释放药物起到局部抗菌作用,局部用药可避免庆大霉素全身使用的副作用,开启了局部载药内植物临床使用的先河。受到庆大霉素珠链的启发,医疗科研人员发明出不同类型的载药内植物用于不同疾病的治疗,肿瘤局部化疗是其中重要的组成部分。局部化疗是指将化疗药物与生物相容性载体相结合,置入体内特定部位后缓慢释放药物,以达到肿瘤局部治疗的目的。局部化疗因局部药物浓度高、全身血药浓度低、药物副作用小等优点而较全身化疗有明显的优势,但传统药物载体如骨水泥等只能使用单一药物、药物释放特性不稳定不可控、需二次手术取出、不能个体化治疗等缺点限制了其临床应用。故急需一种个体化、可多重给药、释药特性稳定可控、无需二次手术取出的新型载药内植物用于骨肉瘤的局部化疗。合适的制作材料是构建良好内植物的关键,本实验所选用的聚左旋乳酸(PLLA)作为手术缝线材料已安全使用近30年,其良好的生物相容性和生物可降解性已被广泛接受,是临床常用的生物材料之一。在骨科临床治疗中,PLLA作为生物可降解材料,既可制作骨科内固定物,也可制作组织工程学支架,具有生物相容性好、可塑性强、降解速度与骨缺损修复速度相对一致等优点。快速成型技术是目前国内外科研领域最为前沿、热点的科学技术之一,对制造业的发展有革命性的影响,已经成为众多国家关注的重点领域。快速成型技术最早由Deckard在20世纪80年代中期发明并获得专利,经过近20年的发展,快速成型技术已经日趋成熟并逐步应用于医疗卫生领域。相对于传统内植物的制作方法,快速成型技术用于载药内植物的制备具有下列优势:个体化定制、精确实体制作、材料多元化、无需组装、制作时间短、制作所需空间小、便携性高、无制造技术壁垒、制作成本与设计复杂程度无直接关联、制作成本与制作多样化无直接关联等。可以依据癌灶部位、形态等具体情况或手术结果制作出不同形态和尺寸的内植物以适应不同患者的需求,根据治疗方案的具体情况可以制作骨髓内、病灶周围软组织、转移部位的选择性个体化载药内植物,使治疗效果最优化、药物副作用最小化,避免药物耐药性和药物滥用情况的发生。良好的生物材料结合快速成型技术带来的全新制造方式为骨肉瘤的局部化疗提供了全新的思路。将快速成型技术与局部载药内植物技术联合应用预期可以达到以下目的:根据患者药物敏感试验和肿瘤病理学特征制定出强针对性的化疗药物组合;依据患者自身情况制作不同剂量或可变剂量的载药内植物;可以实现四载药甚至多重载药配药方案;可以实现药物的同时释放、交替释放、梯度释放,使药物释放的浓度和速度都得到精确调控;根据全身和病灶具体情况可以制定全身、骨髓内、病灶周围软组织、转移部位的选择性个体化治疗方案;可以依据癌灶部位、形态等具体情况或手术结果制作出不同形状和尺寸的内植物以适应不同患者的需求。因此,本研究的主要目的是探讨基于快速成型技术制备个体化可降解多重载药控释内植物用于骨肉瘤局部化疗的可行性。研究目的1、PLLA球形载药内植物快速成形制备及其安全性的研究。2、PLLA球形载药内植物在动物模型体内对骨肉瘤治疗有效性试验研究。研究方法1、运用mimics 10.0软件,根据人体解剖学特征及生物力学,设计出球形、圆柱形的内植物,然后以PLLA粉末成型3D打印技术将材料加工成设计模型,最后制备载药内植物。2、扫描电镜观察PLLA球形打印多孔内植物的微观结构并进行孔隙率测定。3、关于PLLA球形打印载药内植入细胞毒性的研究。测试PLLA球形打印多孔载药内植物对U20S增殖活性的影响。4、PLLA球形内植物对皮肤致敏的试验研究。将PLLA球形多孔内植物浸提液涂于小鼠备皮区,14天后进行皮肤过敏反应评分测定。5、PLLA球形内植物亚急性毒性试验研究。将PLLA粉末用生理盐水配成1%及10%的混悬液,用带有灌胃针头的注射器经口灌胃给药,然后进行一般观察、死亡情况观察、体重测定及大体解剖,并进行脏器重量和组织病理学检查。6、PLLA球形打印载药内植物植入试验研究。将PLLA球形多孔载药内植物植入新西兰大白兔后每天观察记录饮食、自主活动、死亡、手术伤口及病理观察。7、PLLA球形内植物血液相溶性试验研究。进行溶血试验,凝血四项检测,动态凝血试验,血小板粘附试验检测血液相溶性。8、PLLA球形内植物生物降解试验研究。将PLLA球形多孔载药内植物放于洁净的100 ml三角瓶中,并装满人工体液,然后进行pH值测定,吸水率及失重率测量。9、细胞悬液注射法与组织块移植法建立小鼠骨肉瘤模型的比较研究。细胞悬液法及组织块移植法建立小鼠骨肉瘤的模型,然后观察各组小鼠生长情况,测量各组肿瘤大小,并计算各组小鼠的成瘤率。10、载药内植物在动物模型体内释药特性试验研究。将造模成功的小鼠植入PLLA球形多孔载药内植物后进行生物样品预处理及生物分析实验。11、PLLA球形载药内植物在动物模型体内对骨肉瘤治疗有效性试验研究。将造模成功的小鼠肿瘤切除后,植入等体积的载药内植物,并进行治疗有效性评价。实验结果1、球形载药内植物含药量最高,可用其进行后续研究。2、在扫描电镜下,内植物孔道丰富,表面光滑,孔的内壁比较粗糙,有利于细胞的粘附。PLLA球形多孔内植物的孔隙率为(85.14±2.16)%,表明PLLA内植物符合生物材料的要求:孔隙率>80%。3、PLLA内植物的毒性反应分级呈0级或1级,表明该内植物无体外细胞毒性,具有良好的生物相容性。4、本试验研究结果表明,PLLA球形多孔载药内植物对豚鼠无致敏作用,其致敏强度为弱致敏性。5、整个试验期间无动物死亡,各组试验动物临床观察无异常。试验组动物(给予1%、10%PLLA混悬液)体重增长正常,与溶媒对照组无显著差异。试验组动物脏器重及脏体比与对照组相比,无显著差异。6、所有试验动物术后情况良好,饮食及自主活动正常,整个试验过程中无动物死亡。手术伤口部位无红肿、渗液、化脓等感染。所有试验动物伤口 Ⅰ期愈合。PLLA球形多孔载药内植物植入后12w,病理切片可见:植入物周围可见极少量淋巴细胞,炎性细胞的数量明显降低。炎性反应分级为Ⅰ级,囊壁形成为Ⅲ级。7、试验组与阴性对照组相比,溶血程度无明显差异(p<0.05)。试验组血小板黏附率与对照组相比,无显著差异(p<0.05)。8、实验前5周,pH值无明显的变化,维持在7.4左右;从第6周开始,pH值开始明显的降低,至实验结束,pH值下降至6.3左右。载药内植物为多孔结构,水分子可沿孔隙进入到球形内部,随着内植物在PBS溶液中的降解,其吸水率也有所增加;随着时间的延长,吸水率无明显变化,水分子在材料内部已经达到平衡。在降解试验初期,其失重率较低;随着PBS与内植物的充分接触,其失重率增大,至试验结束,失重率可达40%以上。9、细胞悬液注射组共有3只在观察期内未能成瘤,且肿瘤生长的速度较组织移移植法低,其成瘤率为70%。组织块移植组所有小鼠均成瘤,肿瘤生长速度较快,成瘤为100%,明显高于细胞悬液注射法成瘤率(p<0.05)。10、试验动物术后伤口部位无红肿、渗液、化脓等感染。11、手术伤口部位无红肿、渗液、化脓等感染。常规治疗组试验动物出现3例死亡,且该组动物自主活动减少,有脱毛。其余各组动物未见异常。根据micro-CT扫描及肿瘤标志物等指标变化水平评价示抑癌作用明显,治疗有效。结论PLLA球形载药内植物空隙丰富,孔隙率大,含药量高;无体外细胞毒性,具有良好的生物相容性;致敏强度为弱致敏性,无亚急性毒性反应,具有较好的血液相容性,治疗方式无明显严重并发症,安全可靠;将载药内植物植入骨肉瘤的小鼠模型中,实验组肿瘤标志物等肿瘤活性指标表达水平受限,表明该研究治疗方式对骨肉瘤有明显抑制作用,治疗有效。