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目的:观察调控衰老标记蛋白30(Senescence Marker Protein 30,SMP30)含量的改变对人晶状体上皮细胞株(Human Lens Epithelial Cells,HLEC)SRA01/04增殖和凋亡的影响,为白内障病因和预防机制的研究提供新的思路。方法:(1)预感染实验确定SRA01/04细胞是否易于被慢病毒感染及其最佳感染条件:将处于对数生长期的SRA01/04细胞按2×10~3/孔的密度接种96孔板,待细胞密度增至20%时,用慢病毒GV115-NC(pGcsil-004)在四种培养液(完全培养基、含5μg/ml助感染试剂的完全培养基、感染增强液、含5μg/ml助感染试剂的感染增强液)及三种复感染指数(1、10、100)的培养条件下感染SRA01/04细胞,每组三个样本、所有实验至少重复三次。(2)SMP30过表达和沉默稳定株构建:确定好感染条件和最佳病毒滴度后,将处于对数生长期的SRA01/04细胞按5×10~4/孔接种6孔板,待细胞密度增至20%时采用两组RGN(Regucalcin,SMP30)慢病毒LV-RGN(Lentivirus-Regucalcin)和LV-RGN-RNAi(Lentivirus-Regucalcin-RNA interference)以及相应的阴性对照组病毒感染细胞,24h后将感染溶液换成正常完全培养基,感染后72h在荧光显微镜下观察荧光强度。当细胞密度达到90%时,加入2μg/ml嘌呤霉素(Puromycin)杀死未感染细胞,后续细胞传代培养中维持1μg/ml嘌呤霉素持续筛除未被慢病毒感染的细胞。转染成功后,运用WB(Western Blot,蛋白质印迹)和q-PCR(Real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction,实时定量聚合酶链反应)检测SMP30/RGN过表达和沉默效率,以明确细胞株构建成功。(3)细胞增殖和凋亡检测:使用细胞计数试剂盒Kit-8(Cell Counting Kit-8,CCK-8)测量细胞活力,运用5-溴脱氧尿苷(BrdU)测定各组细胞增殖;通过PI FACS周期试剂盒测量细胞周期,并运用流式细胞术通过膜联蛋白-V APC测定细胞凋亡;运用western印迹测定SRA01/04中caspase-3的含量,间接反映细胞凋亡率。结果:(1)通过转染预实验,确定Normal Medium+Polybrene(5μg/ml)(含5μg/ml助感染试剂的完全培养基)和病毒滴度MOI=5为SRA01/04细胞的最佳转染条件。(2)使用q-PCR和WB技术来确定SMP30过表达(Overexpression,OE)和沉默(Knock Down,KD)SRA01/04细胞系的转染效率,OE组(19.373±1.445)的RGN表达量为NC-OE(Overexpression Negative Control Group)组(1.023±0.253)的19.373倍(t=-21.659,p<0.01),相对于NC-KD(Knock Down Negative Control Group)组(1.003±0.1),KD组(0.039±0.003)的沉默效率为96%(t=16.729,p<0.01)。与相应空载组相比,OE组SMP30蛋白表达量(1.338±0.186)显著增高(t=-9.039,p<0.01),KD组SMP30蛋白表达量(0.137±0.048)下降(t=13.006,p<0.01)。(3)通过CCK-8测定,与NC-KD(0.398±0.011)相比,KD组(0.355±0.008)细胞活力下降(t=7.466,p<0.01),OE组(0.415±0.01)与NC-OE组(0.402±0.009)相比没有差异(t=-2.189,p>0.05);Brdu增殖实验显示,与NC-OE组(0.682±0.006)相比,OE组(0.857±0.023)的细胞增殖有所增加(t=6.49,p<0.05),KD组(0.664±0.01)和NC-KD组(0.676±0.008)相比没有差异(t=1.61,p>0.05);PI FACS细胞周期测定结果显示,与相应空载组相比,KD组S期细胞减少(t=11.18,p<0.01)、G1期细胞增多(t=-12.97,p<0.01)、G2/M期细胞无明显变化(t=0.288,p>0.05),OE组S期细胞减少(t=12.643,p<0.01)、G1期细胞增多(t=-11.849,p<0.01)、G2/M期细胞增多(t=-12.447,p<0.01);膜联蛋白V APC信号染色检测显示,与相应空载组比较,KD组细胞凋亡率较高(t=-5.986,p<0.01),OE组细胞凋亡率降低(t=13.181,p<0.05)。通过Western Blot检测发现,与各自对照组相比,OE组caspase-3的表达显著增加,KD组caspase-3的表达明显下降。结论:SRA01/04细胞易于被慢病毒感染,最佳感染条件为用病毒滴度等于5的病毒液在含5μg/ml助感染试剂的完全培养基中感染细胞。慢病毒转染SRA01/04细胞的沉默和过表达效率佳,成功构建的稳定株可以用于后续实验。衰老标记蛋白30含量的增加可以促进人晶状体上皮细胞SRA01/04增殖并抑制其凋亡,增加SMP30的表达量或许可以保护HLEC SRA01/04免受凋亡引起的白内障。