国外药材是中药新药源发掘的重要途径,国外药材引入我国自古以来有很多成功的案例,典型的有西洋参、番红花、郁金等。中西方益母草的基原植物是同属的不同种,西方的是欧洲益母草Leonurus cardiaca,中国的是益母草Leonurus japonicas,两者在中西方的用药有相似之处,对妇科疾病具有相似的疗效,但欧洲益母草治疗的适应症更广,扩展到了神经系统和心血管疾病,而益母草对妊娠和产后疾病具有突出疗效。因此,欧洲益母草可能是益母草潜在的新药源,阐明两者遗传和化学物质基础的差异是新药源发掘的前提,然而目前这方面的研究是缺乏的,主要受到以下方面局限:一是对欧洲益母草西方用药历史的考证受到西方古文献资料来源和语言的局限;二是中药材质量控制标准是单一(或几种)成分的含量,很难关注评价复杂成分;三是分析技术为简单的薄层色谱、HPLC-UV等,难以对复杂成分进行准确的定性定量分析;四是分析样品来源不清,缺乏准确的形态分类鉴定和药材鉴定;五是对两者的化学分析是在不同国家分别进行的,缺乏用统一标准、统一方法对统一样品进行系统的比较分析。因此,要准确阐明欧洲益母草与益母草中西方用药差异的物质基础,必须突破以上局限。本研究对西方欧洲益母草用药历史从1485年欧洲第一本关于植物的书籍德文的《健康花园》(《Gart der Gesundheit》)到2018年的《美国草药典》(《American Herbal Pharmacopoeia》)等德语、希腊语、拉丁语和英语古文献进行了系统考证,同时与中国益母草从东汉的《神农本草经》到明代的《本草纲目》的用药历史进行了比较分析,从而概括出两者用药的差异。在此基础上,对欧洲益母草和益母草进行了系统的群体采样(欧洲益母草:欧洲波兰3个居群,美国4个州17个居群,中国1个居群;益母草:中国7个居群,美国2个居群)并对样品进行形态分类和显微鉴定,经鉴定后的样品进行叶绿体基因组群体遗传学分析和基于UPLC-Q-TOF-MS及UPLC-MS/MS技术结合代谢组学的化学比较分析,旨在准确阐明欧洲益母草与益母草中西方用药差异的物质基础。主要研究结果如下:1.欧洲益母草与益母草的历史文献考证益母草属植物在中西医领域的应用都历史悠久。然而,通过历史文献考证,尽管在Dioscorides的一本记载了 600多种药用植物的《本草》(公元65年)中有一些关于欧洲益母草的错误说法,被一些作者称为益母草的植物的描述实际上与益母草属植物完全不符。波斯医师Aviceanna(980-1037)的著名著作中也没有提到该植物。欧洲益母草最早的文字记载出现在1485年的德国文献(Gartder Gesundheit)中。而欧洲益母草在亚洲最常用的近源药材益母草的文献记载跨域了近2000年,其最早的文字记载出现在《神农本草经》(约公元一世纪)。从文献记载发现,两种药材在历史上从入药部位,用药还是炮制方法,都存在很大差异。欧洲益母草在其有记载的500多年中,无论是炮制方法还是用药方式都是一致的;而益母草在其历史发展中发生了显著变化。例如,在《神农本草经》主要记载是益母草种子的使用。尽管有提到益母草的全草的一种用法,后在其它文献也被引用过,但最终因益母草全草部分的应用无再发展而消失于文献中。从唐朝开始,从记载看到,益母草的入药部分开始从种子转移到了植物全草部分。到李世珍写《本草纲目》(1596年)时,这两个部分已经清楚地分开了,益母草的全草部分已经是重要。即便是到了宋代,我们也可以看到像《太平圣惠方》(992)看到,配方中全草比种子更受青睐,使用比例约为3:1。此外,益母草的应用也从专治产后疾病扩展到到涵盖妇科大多数疾病的广泛应用,我们看到了全草部位的用法发生了变化。到了清朝,欧洲益母草于益母草在妇科疾病中的应用几乎相同。尽管对益母草在治疗产妇神经系统疾病有文献记载,但此应用到了清朝已不受青睐。相比之下,欧洲益母草在焦虑,失眠,心血管病和许多相关疾病的应用中广泛使用。因此,据文献考证,欧洲益母草除了对妇科疾病具有与益母草相似的疗效外,其治疗的适应症还扩展到了神经系统和心血管疾病。2.欧洲益母草与益母草叶绿体基因组群体遗传学分析通过叶绿体基因组群体遗传学分析欧洲益母草和益母草的遗传多样性和遗传结构,以此建立欧洲益母草和益母草产地鉴别或个体鉴别的DNA分子鉴定系统,并对欧洲益母草和益母草的种质资源进行评价和保护利用策略分析,同时推断可用于未来优质化学型选育的基因型或单倍型,为欧洲益母草的开发利用作好资源评估。利用高通量测序的方法,对欧洲益母草22个个体和益母草61个个体的叶绿体基因组进行了测序和组装,结果表明,欧洲益母草和益母草的叶绿体基因组结构基本一致,均为典型被子植物叶绿体基因组的双链环状结构,包括四个部分:两个反向重复区、大单拷贝区和小单拷贝区。基因注释发现两物种编码基因的种类和数量均相同,共编码114个唯一基因,包括80个编码蛋白质的基因,4个rRNA基因和30个tRNA基因。基因组总长度变化范围欧洲益母草的较大,为151,236-151,831 bp,而益母草的较小,为151,395-151,733 bp。基因组种内变异欧洲益母草较小,22个条序列包含238个变异位点,变异率为0.16%,共形成8种单倍型,单倍型多态性为0.732;益母草62条序列包含312个变异位点,变异率为0.21%,单倍型数为52,单倍型多态性为0.99。碱基替换和颠换比例两物种相似,AT/TA颠换均占比最小,但欧洲益母草的CT/GA替换和AC/TG颠换占有明显大的比例,预示着欧洲益母草与益母草有着不同的演化历史。系统发育系和单倍型网状进化树构建的结果显示,欧洲益母草具有明显的谱系地理结构,来自欧洲波兰、美国明尼苏达州IL、俄勒冈州OR、中国新疆的欧洲益母草分别聚为明显的4个分支,表明它们之间没有基因渗透和人为引起的种质混杂,各分支对应的单倍型可以作为产地鉴别的分子地理标识;不同单倍型可能对应不同的化学型,可作为优质化学型选育的分子标记;未来若需在我国引种栽培,应根据不同的单倍型和优质化学型进行引种,切忌盲目无序引种引起种质混杂而导致种质退化。益母草的系统发育树和单倍型网状进化树也形成4个明显分支,但不具有谱系地理结构,同一产地的个体未聚在一支,而是与其它产地个体形成一个多系的进化关系,每一分支对应的单倍型不能作为产地鉴别的分子地理标识,产生这一结果的原因可能是益母草在长期栽培过程中人为引起产地间或居群间种质交流和混杂的结果,因此,益母草种质资源保护利用的关键是种质纯化。3.欧洲益母草与益母草化学成分比较分析首次利用UPLC-Q-TOF-MS和UPLC-MS/MS技术结合植物代谢组技术对不同来源的欧洲益母草和益母草进行了定性和定量分析,以确定欧洲益母草和益母草中主要的化合物及两者的异同和主要差异标记物。基于文献综述建立了益母草属植物中164个化合物分子式和结构式的数据库,并对化合物的特征进行分析,确定了常见的取代基、取代位置,构建了代谢物可能的生物合成途径;利用23个不同结构类型的标准品进行了 UPLC-Q-TOF MS分析,并结合文献,研究分析了黄酮类、苯乙醇苷类、绿原酸类、生物碱类、酚酸等化合物的质谱裂解途径和色谱保留特征,确定了不同化合物的诊断子离子(DPIs)、特征子离子丰度比(DPIR)、中性丢失等信息;在上述质谱和色谱认识的基础上对欧洲益母草和益母草的UPLC-Q-TOF-MS数据进行分析,首先对欧洲益母草和益母草中含量高、结构已知的化合物进行了结构分析和鉴定;进一步结合已鉴定化合物的质谱和色谱特征,综合化合物的ClogP值、分子内氢键、化合物含量等信息对两者中所有化合物的结构进行了分析和结构推测。结果从欧洲益母草和益母草中总共鉴定或推测了 330个化合物的结构,其中潜在的新化合物38个,首次从欧洲益母草和益母草中发现的化合物200多个。鉴定的化合物中包括83个黄酮类化合物、70个苯乙醇苷类化合物、81个葡萄糖二酸类化合物、10个生物碱、11个环烯醚萜苷、13个绿原酸类、10个酚酸及其苷、10个糖及其苷、28个脂肪酸衍生物、10个咖啡酸葡萄糖苷、其它类化合物5个,其中包含70组同分异构体。基本阐明了欧洲益母草和益母草中的代谢物组成。利用植物代谢组分析策略,对不同的欧洲益母草和益母草样品进行UPLC-Q-TOF分析。整体上看两者的代谢物类似,欧洲益母草中苯乙醇苷类化合物含量普遍较高,黄酮类和葡萄糖二酸类虽然不同成分在两者中含量高低不一,但总含量上欧洲益母草更高,欧洲益母草中基本不含益母草碱。为了进一步得到两者差异的关键标记物,将液质数据导入Progenesis QI进行汇总、峰对齐、峰提取、分组等处理,得到不同样品的数据集;一方面利用Excel的Sumproduct功能自动筛选欧洲益母草和益母草中化合物峰面积差异3倍以上的标记物;另一方面利用EZinfo软件通过主成分分析、偏最小二乘法分析、正交偏最小二乘法分析及S-Plot图和VIP值等进行欧洲益母草和益母草中差异较大化合物的寻找和鉴定;结合不同的分析确定了欧洲益母草和益母草中12个关键的差异标记物(毛蕊花糖苷、薰衣草叶苷、益母草诺苷A、异薰衣草叶苷、益母草诺苷B、益母草碱、丁香酸、2-cis-Caffeoyl glucaric acid、菜豆酸、芫花素,益母草叟苷F,芹菜素7-(6’"-香豆酰基)-半乳糖苷),并通过数据验证了 12个化合物可以较好的聚类鉴别欧洲益母草和益母草样品。通过混合样品溶液(无对照品)利用UPLC-Q-TOFMS的方法和通过对照品利用LC-MS/MS的方法对益母草和欧洲益母草中37个主要化合物进行了精确含量比分析并对11个化合物进行了精确定量分析,结果显示欧洲益母草中平均含量是益母草中平均含量3倍以上化合物主要是水苏碱、毛蕊花糖苷、薰衣草叶苷、益母草诺苷A和B、芫花素,还有葡萄糖二酸类及脂肪酸类;益母草中平均含量是欧洲益母草中平均含量2倍以上的有紫云英苷,益母草碱。定量分析结果和定性分析结果一致。综上所述,欧洲益母草与益母草中西方用药存在差异,其差异可能与化学成分差异相关,欧洲益母草对神经系统和心血管疾病的显著疗效可能与欧洲益母草中平均含量高于益母草3倍以上的化合物水苏碱等7种化学成分有关;而益母草对妊娠和产后疾病的突出疗效可能与益母草中平均含量是欧洲益母草2倍以上的化合物益母草碱等3种化合物有关。欧洲益母草不同产地的单倍型可能与化学型相关,可作为优质化学型选育和引种中国的分子标记。