高温胁迫是抑制植物光合作用,导致农作物减产的主要非生物因子之一。虽然植物光合作用本身具有一定的热适应能力,但其作用机制还不清楚。目前已有研究表明中度高温胁迫下光合对高温的适应与Rubisco活化酶(RCA)介导的Rubisco的活化有关。为了进一步研究高温下RCA在调节Rubisco和光合作用中的作用,我们建立了一套对RCA大同工型(RCA_L)和小同工型(RCA_S)精确定量的新方法,并研究了水稻光合热适应过程中RCA在调节Rubisco和光合作用中的作用,以及RCA大小同工型超表达转基因植株的耐热性差异,主要结果摘要如下:利用RCA大小同工型蛋白序列的差异设计引物,对RCA_L蛋白羧基端的特异序列和两个同工型的共同序列进行原核表达。然后利用这两个表达的融合蛋白作为免疫原制备了单独识别RCA_L和共同识别两个同工型的特异性抗体。基于这两个抗体我们建立了一套对RCA同工型进行精确定量的酶联免疫吸附试验(ELISA)定量分析方法。这种方法对于研究RCA大小同工型蛋白的积累具有灵敏和高通量的优点。同时,利用Rubisco和RCA的抗体我们还建立了一种检测Rubisco-RCA复合物数量的双抗体夹心ELISA法。该方法为研究Rubisco与RCA间的相互作用提供了一个新手段。利用以上抗体对不同叶位的RCA同工型定量分析表明,水稻RCA中RCAs的数量约是大同工型的6倍以上,且在叶片衰老过程中RCA_L在总RCA中所占的比例逐渐降低。mRNA分析表明,RCA_L比例的下降与转录水平的改变无关。相关分析表明Pn与Rubisco初始活力具最高的相关性,而Rubisco初始活力与RCA总量、RCA_L和RCA_S含量均具有极显著的相关性,表明RCA_S在体内主要起活化Rubisco的作用,而RCA_L可能起调节作用。在水稻的光合热适应研究中,我们发现光合的热适应与高温下Rubisco初始活力的变化密切相关,RCA_S在调节Rubisco初始活力中发挥了重要作用。蛋白水平和mRNA水平的分析表明,RCA_S含量的恢复不是其mRNA的积累引起的,但RCA_L的热诱导上升与其mRNA的积累相关,高温可能改变了RCA选择性剪接。与此同时,我们还检测到热适应的植株中Rubisco-RCA复合物的数量显著增加,并且该复合物中RCA_L所占的比例在热适应过程中显著增加。因此我们推测,高温下RCA_L表达的上调可能有助于高温下RCA_S催化功能的恢复,从而弥补由于RCA_S的热不稳定导致的Rubisco快速失活,提高光合作用的热适应能力。我们通过农杆菌介导法获得了RCA大小同工型超表达的转基因植株,并进一步研究了RCA_L超表达植株的光合耐受性。通过比较不同温度下不同转基因植株的光合和Rubisco活性,我们证明了水稻体内RCA_S主要起催化Rubisco活化的作用,而RCA_L型能提高光合热稳定性。RCA与Rubisco的结合物分析表明,RCA_L超表达转基因植株的高耐热性与复合物中RCA_L的比例增多有关,其机制可能是大同工型起到了维护RCA_S热稳定性的作用。总之,我们的研究表明,水稻中两个RCA具有不同的生理功能,RCA_S主要活化Rubisco,调节光合速率;而RCA_L具有热激蛋白功能,在调节和维护RCAs的Rubisco活化活性上起作用。