目的：枸杞多糖是枸杞发挥抗肿瘤、抗氧化、免疫调节等作用的重要活性成分,但是由于枸杞多糖空间结构复杂,活性中心多样,分子量庞大等原因使其口服后产生的相关的免疫调节机制作用的研究进展缓慢。本研究采用水提醇沉法提取枸杞多糖后经膜透析得到五个不同分子量段的枸杞多糖产物,并对其主要组成成分及单糖组成进行分析。同时,在研究不同分子量的枸杞多糖对免疫抑制小鼠模型中淋巴细胞归巢受体的表达情况等前提下,本研究进一步采用体外实验对各级多糖进行活性筛选后针对多糖对不同细胞系细胞的增殖及迁移作用进行研究,确定枸杞多糖有效的分子量段和其对细胞迁移的影响。淋巴细胞的归巢再循环是保证机体免疫力的重要途径之一,而细胞迁移是淋巴细胞归巢再循环得前提。同时,细胞迁移是肿瘤细胞“归巢”到特定器官的肿瘤迁移得以实现的基础。本研究通过体内外实验考察枸杞多糖对细胞迁移的影响,为枸杞多糖在工业生产中获得更有效的产品,和在免疫研究及治疗肿瘤方面的开发提供依据。方法：为研究中药水提物的活性,我们选用了小鼠免疫抑制模型。由于中药传统口服的给药方式,决定了肠道黏膜免疫在中药免疫调节作用中的重要角色。前期的研究发现中药多糖能促进免疫抑制小鼠派氏结数目的增多及变大。故本实验首先对免疫抑制模型进行复制。免疫抑制剂诱导的免疫抑制模型是较常用的动物造模方法,但由于文献报道中得给药方法,剂量,时间等相差太大,故本实验首先对环磷酰胺和地塞米松对小鼠免疫抑制程度进行了研究,并首次对两者引起的肠道粘膜免疫的抑制作用进行研究。之后通过对各类中药多糖对DTH免疫抑制小鼠的免疫调节及归巢分子的影响的研究结果选定枸杞作为后续实验的供试品,并进行枸杞多糖的分级提取及提取物的成分分析。通过动物实验探讨了不同分子量段的枸杞多糖对小鼠在体细胞迁移的影响后,为进一步探讨枸杞多糖对细胞迁移的影响而进行体外细胞实验,以便进一步研究枸杞多糖对细胞迁移的影响。主要实验方法操作如下。1、免疫抑制模型的复制：选用环磷酰胺和地塞米松两种免疫抑制剂,从整体免疫和肠道粘膜局部免疫,以及DTH模型小鼠的肠道派氏结和耳后淋巴结中淋巴细胞活化比例为主要观察指标,并结合脏器指数和小鼠DTH反应能力,观察不同剂量的免疫抑制剂的作用效果,选择合适的小鼠免疫抑制模型用于后续研究。2、多糖的筛选：硫酸-苯酚法检测各多糖样品中多糖的含量；通过动物实验检测香菇,枸杞,四君子汤,茯苓,羧甲基茯苓,苦瓜多糖对免疫抑制小鼠DTH的免疫调节作用；通过流式细胞仪检测肠系膜淋巴结中淋巴细胞黏附分子及归巢检测来筛选目的供试品。3、通过水提法及酶法相比较,最后确定枸杞多糖的分级提取及成分分析的方法为：采用水提后,不同孔径的透析膜过滤得到不同的分子量的水提物后再进行醇沉的方法得到分子量不同的产物进行成分分析。煅烧法检测灰分含量；烘培法检测水分含量；硫酸苯酚法检测总多糖；HBAH检测还原性多糖；Bradford法检测蛋白含量；SDS-PAGE分析蛋白的条带及多糖的纯度。四硼酸钠硫酸法检测糖醛酸的含量；HPLC检测多糖中单糖的含量,并对各组分包括蛋白质进行成分对比分析。4、枸杞多糖对正常小鼠及免疫抑制小鼠淋巴细胞迁移的影响。BALB/c小鼠腹部注射环磷酰胺后灌服枸杞多糖一周,通过胸腺脾脏脏器指数、肠道派氏结个数及肝静脉血和派氏结中淋巴细胞比例等来观察枸杞多糖对健康小鼠的免疫增强作用。通过对灌服多糖的免疫抑制小鼠肠道淋巴细胞的迁移分子的流式检测来观察多糖对免疫抑制小鼠免疫功能的恢复作用。5、枸杞多糖对肿瘤细胞增殖及迁移的影响：MTT法检测细胞的增殖,并对细胞浓度,贴壁时间等因素进行实验研究；DNA梯度条带检测细胞凋亡。细胞伸展,贴壁实验,划痕实验及Trans-well实验则对细胞的迁移进行研究。结果：1、各浓度的环磷酰胺和地塞米松都有一定的免疫抑制作用,其中以环磷酰胺100mg/kg和地塞米松40mg/kg在给药后48h即可对小鼠脏器指数、派氏结数目、DTH反应及DTH反应下小鼠耳后淋巴结和肠道派氏结中淋巴细胞比例和活化均有显著抑制作用,与对照组比较具有统计学意义。地塞米松对小鼠脏器指数和肠道派氏结数目具有显著抑制作用,但对小鼠DTH反应及DTH反应条件下T细胞活化的抑制作用不明显,且地塞米松诱导的脏器缩小明显,影响组织的摘取和原代细胞的分离培养。故本实验选择环磷酰胺腹腔注射100mg/kg给药48h后造成的免疫抑制模型进行实验。2、硫酸-苯酚法检测各样品中多糖含量：香菇52.0%,枸杞60.4%,四君子汤24.03%,茯苓84.9%,羧甲基茯苓86.8%,苦瓜水提物83.8%。香菇,枸杞,四君子汤,茯苓,羧甲基茯苓,苦瓜等水提物对环磷酰胺抑制的DTH小鼠免疫调节作用及淋巴细胞归巢受体的表达的结果发现,各类水提物对免疫抑制模型小鼠均有一定的免疫增强作用,但作用的侧重点并不相同。其中枸杞多糖对其免疫调节及淋巴细胞归巢受体的表达作用效果比较明显,且价格低廉。故本实验选用枸杞作为本实验的供试品。3、枸杞多糖的分级提取和成分分析：由于不同酶的作用条件及作用环境不同,在探讨不同工业酶对枸杞提取方面的研究时本人发现：由于酶的作用温度比较低,所以在PH4.5-8之间酶对枸杞原材料的的提取率是比高温提取要低的。不同PH值得水溶液对多糖中还原性糖的提取没有差异。蛋白的含量随着PH值得提高有上升的趋势,但总体差异不大。说明提取物中蛋白质含量较少。故最终决定选择传统的水提醇沉法,水提液通过不同孔径膜透析得到不同分子量段的透析液,在进行醇沉,得到相关的不同分子量的产品NO.1-NO.5。4、不同分子量产品的成分分析：通过化学分析手段对NO.1-NO.5的成分进行分析,结果发现在醇沉的基础上再进行醇沉所得到的NO.2号产品中的灰分,蛋白和粗脂肪等杂质的含量很低。而通过一次醇沉得到的NO.1,NO.3,NO.4和NO.5产品中,各灰分,粗脂肪等含量接近,但蛋白质含量以NO.4最低为0.11%,NO.1的最高,达到2.04%。在比较各产品的总糖,还原性糖和糖醛酸时,我们发现NO.2的各种糖类含量最高,尤其总糖含量为66.88%,远远高于其他类产品；其次是NO.4为55.8%。在HPLC分析中,以葡萄糖,木糖,纤维二糖,来苏糖为标准品,分析结果显示NO.1-NO.5的单糖成分,NO.1单糖成分含量很少,只含有葡萄糖和木糖且含量很低,另外几种产品单糖的成分及含量都相近；NO.2与NO.4的单糖的含量最为接近,且各单糖含量略高于其他产品。5、小剂量的不分子量段的枸杞产品,在给药14天后,并不能抵抗环磷酰胺对小鼠的免疫抑制作用所导致的胸腺、脾脏脏器指数的降低,及派氏结数目的减少等。但肝静脉血中,B淋巴细胞的比例有所恢复,同时肝静脉血中淋巴细胞的黏附分子的表达增多。但派氏结中淋巴细胞的比例及黏附分子的表达与Cy组比较并没有差异性。大剂量枸杞多糖NO.4能明显改善免疫抑制小鼠的整体免疫和肠道黏膜免疫,给予多糖后,胸腺脾脏指数增加,肠道淋巴细胞细胞比例恢复。同时派氏结中淋巴细胞归巢受体表达增加,但肝静脉血中细胞黏附分子的表达并没有变化。同时,研究表明给予环磷酰胺后,肝脏及派氏结中淋巴细胞表达黏附分子的比例与正常组相比有增加的趋势,虽然这种趋势无统计学意义。6、枸杞多糖对肿瘤细胞增殖的影响：本研究筛选了宫颈癌细胞Hela,肺癌细胞A549,成纤维细胞L929等三种在研究报道中应用较多的细胞系进行研究,发现在0.8mg/ml时,各类细胞对多糖产品的敏感性并不相同,以Hela) L929) A549。通过研究发现在细胞浓度为3×103细胞／孔时,贴壁时间在2-6h时,NO.4产品对细胞的抑制作用明显。细胞浓度过高,或者贴壁时间过长,都会影响到样品对细胞的抑制作用。当细胞浓度达到3×104时,只有5mg/ml的NO.4才会对hela细胞有一定的抑制作用,低于此浓度的枸杞多糖并没有表现出明显的抑制作用。这说明枸杞多糖对细胞的作用具有一定的有效浓度,过高和过低都会影响到其作用效果,并且不同分子量的五个样品对肿瘤细胞的抑制作用也不相同,以Hela细胞为研究对象,通过时间和计量筛选实验得出NO.4>NO.2>NO.5>NO.3>NO.1。同时,本实验探索了NO.4对Hela细胞的增殖抑制作用：DNA梯度条带说明NO.4对细胞具有直接杀死的作用,即通过诱导细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的增殖。但此作用并不排除细胞毒性作用,因为对L929也有此作用,但并没有凋亡条带的产生。7、为了证明NO.4是否具有细胞毒性,小鼠脾脏,胸腺,即肠道派氏结原代细胞进行细胞毒性实验,发现NO.4并没有杀死细胞,相反具有保护原代细胞死亡的作用。8、为了进一步研究枸杞多糖对细胞迁移的影响,本研究选用低剂量,高细胞浓度进行细胞抑制实验。发现在6孔板中,0.8mg/ml的枸杞多糖NO.1-NO.5对细胞浓度为2×105细胞/孔,培养24h后的抑制率及DNA条带显示其作用并不明显。故,本实验部分应用此条件进行细胞迁移实验。结果发现NO.4能明显抑制Hela细胞的伸展,黏附,及迁移。结论：1,环磷酰胺和地塞米松高剂量腹腔注射一次后,能明显的抑制小鼠整体和肠道局部粘膜免疫。且环磷酰胺的抑制结果优于地塞米松,更利于免疫抑制模型的建立。2,PH 5-7的水溶液对枸杞的提取率最高。水提醇沉法对枸杞多糖的分分子量段提取时,各组分中所含的成分种类差别并不大。但是每一组分的成分含量会有所差别,其中分子量段为20nm-8kDa之间的NO.4多糖含量最高。还原性糖和蛋白质多糖复合物的比例接近1：1,糖醛酸的含量最高。所含其他杂质,如脂肪,灰分相对其他产物较少。3,香菇,枸杞,四君子汤,茯苓,羧甲基茯苓,苦瓜等水提物对环磷酰胺抑制的DTH小鼠免疫及派氏结中淋巴细胞归巢受体的表达均有不同程度的促进作用,但是整体看来香菇多糖和枸杞多糖的效果要优于其他水提物。4,枸杞多糖的分子量段为20nm-8kDa之间的产品的免疫调节作用较强,但此作用与给药剂量和给药时间的关系密切。同时,NO.4能促进PPs中淋巴细胞的迁移。5,枸杞多糖的中间分子量段的产品NO.4能很好的抑制Hela细胞和成纤维细胞L929的增殖,此作用对A549影响不大。说明不同细胞系对枸杞多糖的敏感性不同。同时能抑制Hela细胞和成纤维细胞L929的伸展,贴壁和迁移,并且以NO.4的抑制迁移程度最好。说明枸杞多糖对肿瘤细胞的作用具有选择性且与分子量的大小有关系。总之,中间分子量段的枸杞多糖具有较高的生物活性,且此活性不仅与多糖的含量有关,也与其中其他成分和单糖组成及比例有关。