论文部分内容阅读
我国是世界第二大农药生产国,同时也是第一大农药消费国,农药污染问题十分严重。近几年随着国内甲胺磷、对硫磷等高毒农药品种的禁用,毒死蜱(Chlorpyrifos)等中低毒品种被广泛使用,其污染问题也随之而来。由于毒死蜱对人类健康构成了潜在威胁,毒死蜱污染的监测也成为了迫切需要重视的问题。以ELISA试验为主的免疫检测技术因为具有快速、灵敏、可靠、通量大等优点,是一种适用于农药污染现场监测的分析方法,因此,本课题以毒死蜱为目标农药,制备了毒死蜱单克隆抗体并初步建立了毒死蜱的ELISA检测方法。本文从以下方面开展了研究:一、毒死蜱完全抗原的合成与鉴定毒死蜱的相对分子量只有350.62,本身没有免疫原性,必须先将其与载体蛋白质偶联制备人工完全抗原。在碱性条件下,将毒死蜱原药与3-巯基丙酸加热回流反应,使毒死蜱分子吡啶环上第6位氯原子通过亲核取代反应被3个直链碳原子的3-巯基丙酸取代而合成了半抗原O,O-二乙基-O-[3,5-二氯-6-(2-羧乙基)硫代-2-吡啶基]硫逐磷酸酯,随后通过碳二亚胺(EDC)法分别以牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)为载体蛋白合成了毒死蜱人工免疫抗原和包被抗原。用紫外光谱法和钼兰比色法对上述人工合成的抗原进行鉴定,结果表明:人工合成的完全抗原的最大紫外吸收峰与各自原载体蛋白及半抗原相比均发生了变化,2种完全抗原最大紫外吸收峰的位置明显向远紫外区偏移,间接说明了完全抗原的合成是成功的。钼兰比色法测定完全抗原中磷含量并计算出人工合成的免疫抗原和包被抗原中载体蛋白与毒死蜱的结合比分别为1∶64与1∶19。二、毒死蜱单克隆抗体细胞株的制备及筛选用合成的免疫抗原按常规免疫方案免疫Balb/c小鼠,经间接ELISA检测小鼠血清效价达到要求后,选择血清效价最高的小鼠用于细胞融合。用50%聚乙二醇(PEG)融合小鼠的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0并以HAT培养基选择性培养融合细胞,间接ELISA检测和间接竞争ELISA检测筛选出阳性杂交瘤细胞,再经过多次有限稀释克隆后得到稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。小鼠血清效价检测显示被免疫小鼠均产生了抗毒死蜱的抗体,其中A2小鼠产生的抗体效价最高,达到1∶20000以上。融合细胞经多次筛选和克隆后得到2株阳性杂交瘤细胞,间接ELISA检测发现2株细胞的培养上清液与载体蛋白OVA、BSA反应呈阴性,与合成的包被抗原反应呈阳性,间接竞争ELISA检测表明毒死蜱能与2株细胞上清液内的抗体进行特异性结合,因此,该2株细胞是我们期