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目的:心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)损伤严重影响冠心病患者预后,尚无有效治疗措施。钙超载是I/R损伤产生机制之一,肌浆网钙ATP酶2a(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase,SERCA2a)是一种钙调蛋白。本课题前期结果示I/R损伤降低SERCA2a表达和活力,过表达Sumol预处理增强SERCA2a SUMOylation,减轻钙超载,但I/R损伤导致SERCA2a SUMOylation减少机制不明。本课题拟在细胞水平和在体水平探讨I/R后SERCA2a SUMOylation减少的机制及其促进心肌I/R损伤的作用。方法:1)研究SERCA2a蛋白在I/R损伤中维持钙稳态的调节作用。利用Serca2aflox小鼠制备SERCA2a KO小鼠,利用SERCA2a KO小鼠和野生型C57BL/6J小鼠构建心肌I/R损伤模型,Langendoff法分离缺血区单个心肌细胞,检测单个细胞钙瞬变及收缩舒张功能观察SERCA2a对于心肌细胞钙稳态的调节作用及对心肌收缩及舒张能力的影响(n=3)。2)研究I/R损伤对SUMO系统的影响。采用C57BL/6J小鼠,Langendoff法分离的单个心肌细胞,HL-1细胞构建不同时间点(Sham,I/R Oh,I/R 2h,I/R 6h,I/R 12h,I/R 3d)的心肌I/R损伤模型和细胞模拟I/R损伤模型(simulated ischemia/reperfusion,sI/R),RT-qPCR 和 Western bolt 法检测 I/R 损伤不同时间点Sumo1,Ubc9,Senp1,Senp2转录和蛋白水平表达,利用激光共聚焦显微镜结合免疫荧光检测 Sumo1,Ubc9,Senp1,Senp2,SERCA2a 空间定位(n=3)。3)研究 I/R损伤导致SERC2a SUMOylation减少的机制。构建过表达SENP1蛋白和SENP2蛋白的腺病毒及对照病毒,感染HL-1细胞,sI/R损伤后采用Annexin V-APC/7-AAD染色检测细胞的凋亡率。在体水平,心肌内注射腺病毒过表达SENP1蛋白和SENP2蛋白,3d后构建I/R损伤模型,免疫沉淀检测SERC2a SUMOylation;TTC-Even blue双染法检测心梗面积;心脏超声检测心功能(n=3)。GraphPadPrism5.0软件分析数据,计量资料以均数±标准误表示(mean±S.E.M.),两两比较采用q检验,多组间比较采用单因素方差分析,p<0.05为有统计学意义。结果:1.与Sham组相比,Serca2a mRNA及蛋白表达在I/R组降低(p<0.01);SERCA2a敲除小鼠制备成功,Serca2aKO组Serca2a mRNA降低至11.41±9.55%,蛋白表达降低至5.6±1.38%;钙瞬变结果示:与WT组的△FFI(0.34±0.17)相比,I/R损伤组△FFI(0.18±0.09)降低(p<0.05),SERCA2a KO组△FFI(0.27±0.11)未见明显减低,Serca2a KO+I/R组降低(p<0.001);与Serca2a KO组相比,Serca2a KO+I/R组△FFI(0.06±0.12)降低(p<0.001),与I/R组相比Serca2aKO+I/R组降低(p<0.05)。检测单个心肌细胞收缩功能结果示:与WT组(4.13±2.37μm)相比,I/R损伤组单个细胞收缩幅度(1.71±0.97 μm)降低(p<0.01,Serca2a KO组(4.23±1.84μ m)未见明显减低,Serca2aKO+I/R组(0.62±1.65μm)降低(p<0.001);与Serca2a KO组相比,Serca2a KO+I/R组降低(p<0.01);与I/R组相比Serca2a KO+I/R组降低(p<0.05)。2.在体心肌和心肌细胞中,与Sham组相比,Sumo1mRNA和蛋白表达从12h减少,持续至3d(p<0.01),Senp1,Senp2mRNA 6h表达最高,12h开始下降持续至3d(p<0.05);Ubc9组间差异无统计学意义。在HL-1细胞中,与Sham组相比,Sumo1,Senp1,Senp2 mRNA和蛋白表达在sI/R 12h时上升至最高,3d时表达回落(p<0.01);Ubc9和Sham组相比组间差异无统计学意义。免疫荧光结果示SENP1蛋白和SENP2蛋白分布在心肌细胞的胞浆和胞核中,SENP1与SERCA2a蛋白在Z线处存在共定位,SENP2在I/R损伤后出现局部表达升高,而SENP1未出现I/R损伤后的局部表达升高。3.1)检测过表达/抑制SENP1和SENP2的腺病毒小鼠心肌和HL-1细胞中SENP1和SENP2蛋白表达,与Sham组相比,Ad-senp1,Ad-senp2组SENP1,SENP2蛋白表达升高,P<0.01;Ad-senp1-shRNA3,Ad-senp2-shRNA3 抑制效率最高,p<0.01。2)免疫共沉淀结果示:与Sham组相比,I/R损伤组,Ad-GFP+I/R组Ad-RFP+I/R组降低SERCA2a SUMOylation(p<0.001),Ad-Senp1+I/R 组和 Ad-Senp2+I/R 组进一步降低SERCA2a SUMOylation(p<0.05),与 I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp1-shRNA3+I/R 组未见升高 SERCA2a SUMOylation(p<0.05),Ad-Senp2-shRNA3+I/R 组升高 SERCA2a SUMOylation(p<0.001)。3)Annexin V-APC/7-AAD染色结合流式细胞仪检测示:与Sham组相比,I/R损伤组,Ad-GFP+I/R组,Ad-RFP+I/R 组 HL-1 细胞凋亡率升高,分别为 33.43±3.30%,37.05±3.88%,34.1± 1.99%(p<0.001);Ad-Senp1+I/R 组凋亡率达 53.20 ±2.23%(p<0.001);Ad-Senp1+I/R 组相比,Ad-Senp1-shRNA3+I/R 组降低凋亡率,达 32.6±1.11%(p<0.001);但与 I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp1-shRNA3+I/R组并未降低凋亡率。Ad-Senp2+I/R组凋亡率进一步上升,达79.20±4.91%(p<0.001);与 I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp2-shRNA3+I/R组降低凋亡率(p<0.004)。TTC-Evenblue心肌梗死染色结果示:和 Sham 组 5.99 ± 1.25%相比,I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组心肌缺血危险面积百分比升高,分别为38.72±2.64%,34.02± 4.55%,38.99±2.10%(p<0.001);Ad-Senp1+I/R组和Ad-Senp2+I/R组缺血危险面积百分比升高,达59.18±0.95%和64.01±3.83%,与I/R损伤组,Ad-GFP+I/R组,Ad-RFP+I/R组,Ad-Senp1+I/R组相比,Ad-Senp1-shRNA3+I/R组未降低缺血危险面积百分比,达55.54±2.13%(p<0.001);Ad-Senp2-shRNA3+I/R组降低缺血危险面积百分比,达26.20±1.95%(p<0.0015)小鼠心脏超声结果显示:和Sham组66.35± 1.728%相比,I/R损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组射血分数(Ejection fraction,EF)下降,分别为39.96 ± 6.70%(p<0.001),50.02±4.70%(p<0.05),46.35±4.67%(p<0.01);与I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp1+I/R 组 EF 为 53.40±3.36%(p>0.05),Ad-Senp1-shRNA3+I/R 组 54.18±1.01%(p>0.05);与 I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp2+I/R 组 EF 进一步下降至 28.96±2.22%(p<0.05),与Ad-Senp2+I/R 组 EF 相比,Ad-Senp2-shRNA3+I/R 组 EF 值恢复,达 60.19±7.15%(p<0.01)和 Sham 组 35.92±1.36%相比,I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组短轴缩短率(Fractional shortening,FS)下降,分别为 19.16 ±3.54%(p<0.001),25.13.02±3.08%(p<0.05),22.88±2.60%(p<0.01);与 I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp1+I/R 组 FS 为 27.03±2.25%(p>0.05),Ad-Senp1-shRNA3+I/R 组 27.36±0.74%(p>0.05);I/R 损伤组,Ad-GFP+I/R 组,Ad-RFP+I/R 组相比,Ad-Senp2+I/R 组 FS 进一步下降至 13.14±1.14%(p<0.05),与Ad-Senp2+I/R 组 FS 相比,Ad-Senp2-shRNA3+I/R 组 FS 值恢复,达 31.38±4.80%(p<0.01).结论:本研究重点阐述了 I/R对SUMO系统的影响及I/R损伤中SERCA2aSUMOylation减少的机制及其促进心肌缺血/再灌注损伤的作用。1.I/R损伤降低钙瞬变和单个心肌细胞收缩幅度,SERCA2a敲除进一步减少I/R损伤后心肌细胞钙瞬变和单个心肌细胞收缩幅度,加重细胞内钙超载。2.在体和心肌细胞水平证实I/R损伤可以在12h降低Sumo1 mRNA和蛋白表达,在 6h 时升高 Senp1 和 Senp2mRNA 和蛋白表达;HL-1 细胞 Sumo1,Senp1,Senp2mRNA和蛋白表达在sI/R 12h时上升至最高,3d时表达回落,同时证实SERCA2a和SENP1在心肌细胞Z线处存在共定位,SENP2蛋白在I/R损伤后在心肌细胞局部表达增多。3.研究证实I/R损伤后可以通过上调SENP1和SENP2蛋白减少SERCA2a SUMOylation;抑制SENP2蛋白可以恢复I/R损伤引起的SERCA2a SUMOylation减少,细胞凋亡,减少心梗面积,改善心功能,而抑制SENP1蛋白不能恢复以上指标。