论文部分内容阅读
目的：构建并鉴定携带人白细胞介素12基因(IL-12)和人IFN-γ诱导蛋白10基因(IP-10)的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭分泌型表达载体，探索抗肿瘤基因治疗的新型载体。 方法：用双歧杆菌选择性性培养基(BL)从健康男性青年新鲜粪便中分离人双歧杆菌的天然质粒。通过PCR方法克隆该双歧杆菌质粒聚合酶基因(BPP)及其内源性阿拉伯糖苷酶的启动子和分泌性信号肽DNA序列(ara)。然后以大肠杆菌质粒pBAD-A和pBS-T为基础，以ara启动子取代原有的启动子，以绿色荧光蛋白基因(GFP)作为报告基因，构建了大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP。通过PCR方法从真核表达载体pORF-hIL-12质粒和pBLAST49-hIP-10质粒上分别扩增IL-12基因和IP-10基因，分别克隆到穿梭质粒pBS-BPP-ara-GFP中，采用电转化法将正确克隆的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭质粒导入双歧杆菌中，并以L-arabinose诱导表达。在激光共聚焦显微镜下观察转基因双歧杆菌中GFP蛋白的表达；运用免疫蛋白质印迹(Western blot)检测转基因双歧杆菌中IL-12和IP-10的蛋白表达水平。 结果：(1)成功分离到一株携带天然质粒的人双歧杆菌并成功克隆到了该双歧杆菌质粒的BPP及其ara基因，经序列测定，确定它们都是DNA分子，分子量大小分别为1963bp和429bp。通过序列分析与GenBank中相应基因同源性为96％。经形态学观察、糖发酵试验和其他理化性质鉴定，证明该菌株为长双歧杆菌(Bifidobacterium longium)。(2)含GFP基因的转基因双歧杆菌在激光共聚焦显微镜下观察到绿色荧光。(3)含IL-12基因的转基因双歧杆菌经Western blot检测到分子量为58.38kD的目地蛋白条带。(4)含IP-10基因的转基因双歧杆菌经Western blot检测到分子量为8.47kD的目地蛋白条带。 结论：(1)成功克隆到了双歧杆菌质粒的BPP及其are；(2)构建的GFP原核表达载体pBS-BPP-ara-GFP能表达出GFP蛋白；(3)构建的IL-12原核表达载体pBS-BPP-ara-IL-12能表达出IL-12蛋白；(4)构建的IP-10原核表达载体pBS-BPP-ara-GFP-IP-10能表达出IP-10蛋白；