研究背景 “证”是疾病处于一定阶段病因、病位、病性和病势的综合，能体现患者的整体性特征。肝郁证是指由于肝的疏泄功能异常，疏泄不及而致气机郁滞所表现的证候。“肝”的生理特点决定了肝郁证在临床中的重要地位，“诸郁源乎肝”(何梦瑶《医碥》)，肝郁证为病广泛，常见于临床多种疾病中，是中医脏腑证候中常见的证候之一，也是中医肝病发病学的主要环节。临床流行病学资料显示，在五脏病证中，中医肝脏病证占总体病证的40％，车氏等研究属脏腑辨证的9524份病例中，肝郁相关证候占16.58％。由于本证涉及许多疾病，而且常常衍变转化为其他证候，影响面大，危害甚广，已成为中医学病证研究领域的重点脏腑证候。 目前，肝郁证的研究多借鉴现代医学的理论、方法和手段，通过某些微观指标对肝郁进行描述。肝郁形成与人类所特有的极端复杂的情感、社会性等相关。动物模型和几个微观的理化指标，能够在多大程度上客观、真实地反映出肝郁这种心身功能失调的复杂病理状态?依据动物实验的结果，又能有多大把握指导临床实践?这是一个值得以审慎态度进行商榷的问题。而且目前研究都只反映了其部分内容，远未揭示证的实质。所以，要对肝郁相关证候进行深入、系统的探究，有助于对郁证及其它心身疾病和情志病的进一步认识和治疗。 蛋白质组学是一门在整体水平上高通量、大规模研究蛋白质组成及其动态变化的活动规律，以便得到疾病过程、生理过程和生化过程中的整体、整合概况的新兴学科。血浆蛋白质是一种十分复杂和多样化的基质，数量多、来源广泛、可能包括人体内几乎全部的蛋白质，血浆蛋白水平的变化与多种疾病有关。血浆是取材容易、应用广泛、富含蛋白质的研究样品。血浆蛋白质组学技术可以在整体水平上以非侵害性的动态检测血浆蛋白的变化，寻找疾病相关蛋白，并由此在血浆蛋白水平获得疾病过程和药物干预过程的外在、综合的认识，成为医学基础和应用研究中的有力工具，被广泛应用。 实验方法 目的： 运用蛋白质组学双向凝胶电泳和质谱技术，辨病与辨证相结合，以不同疾病组肝郁证病人和正常人的血清为样本，通过二维凝胶电泳分离蛋白质组分制备蛋白质谱图，分析比较正常组与肝郁证组血清蛋白质谱图，发现差异蛋白群，并利用生物质谱技术及生物信息学技术鉴定与肝郁证相关的蛋白质。从整体上探讨肝郁证特有差异蛋白质的表达，以期为进一步研究揭示肝郁证候的重要相关蛋白质特性、证候的蛋白质分子微观辨证、诊断学指标方案奠定基础。 方法： 选取诊断明确的抑郁症、经前期综合症、更年期综合症门诊、住院患者各组各10例，本次研究辩证标准参照湖南医科大学金益强等人通过流行病学调查制定的和北京中医药大学陈青红、陈家旭通过文献研究筛选的诊断标准制定：①主症：情绪抑郁或情志不宁；胸胁作胀或痛；心烦不安；口苦；咽部异物感；善太息。脉弦。以上7条中具备任意4条或4条以上即可诊断为肝郁证。肝郁证30例与正常对照组10例的血清标本获得后，采取标本混合的策略，将每样本按各组等质量混和后，直接上样。双向凝胶电泳的第一向电泳采用固相PH梯度电泳，电泳条件采用“纸桥”加再结合低电压设置，能够有效去处样品中的盐和其他的一些杂质对IEF聚焦过程的干扰，改善蛋白的分离。第二向采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析血清蛋白质组成分。电泳后染色采用了Giovanni提出改良的胶体考染法，有效的兼顾了胶体染色的灵敏度和质谱的兼容性。ImageMaster双向凝胶电泳软件分析，将有意义的差异蛋白质点胶内胰蛋白酶解，经过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)鉴定。 结果： 1.对血清双向凝胶电泳的关键步骤改进和优化后获得了较好的肝郁证各组患者及正常人血清蛋白质组双向电泳图谱。 2.正常人与肝郁证患者血清蛋白质组相比较，经ImageMaster2DElite图像分析软件分析计后发现肝郁证差异蛋白质群。校正后蛋白质点的表达量与对照组相差2倍以上，而且在所有凝胶均或同类型凝胶中全部出现，视为差异蛋白质。共找到12个差异表达的蛋白质，其中spot73仅在正常组中表达，在肝郁证三组中缺失；spot171(mp-1)仅仅在肝郁证疾病三组中表达；spot563、71、535、54、538、43、50、530、115、119均在肝郁证三组表达上调。 3.我们对正常人与肝郁证患者血清蛋白质组双向凝胶电泳图谱的12个差异蛋白质中进行了质谱鉴定，经切割、脱色、还原、烷基化、胰蛋白酶酶解、萃取、脱盐后，用MALDI-TOF-MS并以基质峰、酶自动降解片段峰进行校正，测得各自的肽质指纹图谱((PMF)。进行鉴定的12个蛋白点中1个未打出质谱峰，出峰但查询结果为阴性的有3个。仅在正常组中表达的spot73未打出质谱峰，仅在肝郁证疾病三组中表达的spot171(mp-1)为胆汁酸受体(FarnesoidX-activatedreceptor)，均在肝郁证三组表达上调的spot535与538、spot71、spot54、spot50、spot530、spot119分别为锌a2糖蛋白(ZAG)、EALL419蛋白、载脂蛋白A-Ⅳ、触珠蛋白、抗胰蛋白酶、P15蛋白。 结论： 1.根据蛋白质不同的分子量和等电点，通过双向凝胶电泳技术可将人血清中蛋白质成分进行分离，并可利用分析软件，找到不同疾病肝郁证状态下血清中的差异蛋白质。 2.肝郁证患者与正常人相比，在血清蛋白质组成分中存在差异。 3.找到的这些差异蛋白质为下一步的证候差异蛋白的功能验证及进一步扩大研究范围，进行多病种肝郁证相关蛋白的研究，最终揭示肝郁证候的重要相关蛋白质特性作了有益的探索。 4.本研究结合动物模型结果提示肝郁状态可能存在肿瘤的易感性。