论文部分内容阅读
【目的】:急性肾损伤(Acute Kidney Injury,AKI)是一种临床常见的疾病,可导致住院患者住院时间延长、医疗消费增加,且临床预后差。缺血再灌注损伤是AKI最常见的原因之一。微小RNA(Micro RNAs,mi RNAs)是一组高度保守的单链非编码小RNAs,在转录后水平调节基因表达。Micro RNAs在许多生物学过程中起重要作用。一些研究显示mi R-192在肾脏纤维化过程中发挥着重要的作用,但是mi R-192在缺血再灌注性AKI中的表达及其可能的作用机制目前尚不清楚。本研究旨在了解缺血再灌注性AKI后血浆和肾脏micro RNA表达谱的改变、mi R-192在损伤过程中的动态变化及其相关靶基因的作用,以阐明mi R-192在缺血再灌注性AKI中可能的机制。【方法】1.18只雄性SD大鼠随机分为假手术组(Sham,n=9)和双侧肾脏缺血再灌注损伤组(Ischemia-reperfusion Injury,IRI,n=9)。采用PCR array方法检测两组大鼠血浆和肾组织micro RNA表达谱的改变。Realtime PCR方法验证mi R-192的表达,并观察再灌注1h、3h、6h、12h、24h血浆和肾组织mi R-192的动态改变(每组每个时间点n=6)。HE染色观察肾组织学改变。免疫印迹法(WB)检测肾损伤分子-1(Kidney Injury Molecule-1,KIM-1)评估肾小管损伤情况。2.采用Target Scan,micro RNA.org和Mi RDB三个数据库大鼠mi R-192-5p进行靶基因预测并进行信号通路和功能富集分析。选择三个数据库同时预测到的保守靶基因并挑选其中细胞增殖、细胞周期及细胞凋亡密切相关的靶基因BLCAP(Bladder cancer associated protein)进行验证。构建含有BLCAP 3’UTR区域的双荧光素酶报告质粒和mi R-192表达质粒共转染工具细胞HEK293T,并检测两种荧光素酶的活性,验证mi R-192和靶基因BLCAP 3’UTR区域的结合。mi R-192 mimic和inhibitor转染细胞后检测BLCAP蛋白水平验证mi R-192是否可以调节靶基因蛋白表达。WB检测IRI大鼠肾组织和缺氧再复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)刺激后大鼠近端肾小管上皮细胞NRK52E内BLCAP的表达。3.缺氧再复氧(Hypoxia/Reoxygenation,H/R)刺激NRK52E后CCK-8检测细胞活性,流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期,Realtime-PCR检测细胞周期相关基因及mi R-192的表达。RNA干扰技术敲减BLCAP后CCK-8检测细胞活性、流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡情况的改变。【结果】:1.大鼠双侧肾脏缺血再灌注24小时后,血浆肌酐、尿素氮水平显著升高,肾组织KIM-1表达上调,HE染色提示肾组织学的损伤,提示大鼠急性缺血再灌注性肾损伤动物模型构建成功。大鼠血浆micro RNA表达谱分析结果显示共发现差异表达mi RNAs 42个,其中差异>3倍以上的mi RNAs共有22个,包括上调的mi RNAs有15个(mmu-mi R-409-3p、mmu-mi R-685、mmu-mi R-375、mmu-mi R-192、mmu-mi R-2182、mmu-mi R-429、mmu-mi R-1894-3p、rno-mi R-204#、rno-mi R-219-1-3p、mmu-mi R-1961、mmu-mi R-467b、mmu-1954、mmu-mi R-1960、mmu-mi R-674和rno-mi R-504)和下调的mi RNAs共7个(mmu-mi R-126-5p、mmu-mi R-26a、mmu-mi R-544、mmu-mi R-541、mmu-mi R-335-3p、hsa-mi R-338和mmu-mi R-1930)。大鼠肾组织mi RNAs表达谱分析发现17个差异表达的mi RNAs,包括8个上调的mi RNAs(分别为rno-mi R-384-3p、rno-mi R-551b-5p、rno-mi R-125b-1-3p、rno-mi R-7b、rno-mi R-7a-5p、rno-mi R-708-3p、rno-mi R-494-5p和rno-mi R-92a-1-5p)和9个下调的mi RNAs(分别为rno-mi R-299b-3p、rno-mi R-3596a、rno-mi R-3596d、rno-mi R-143-5p、rno-mi R-329-5p、rno-let-7c-1-3p、rno-mi R-455-3p、rno-let-7e-3p和SNORD95)。2.在动态研究中,大鼠血浆肌酐在IRI 3h时开始升高,尿素氮水平在IRI 6h时开始升高,二者均在IRI 12h达峰值,24h时开始下降但仍显著高于假手术组,IRI后3d时血浆肌酐、尿素氮水平恢复至基线水平。HE染色显示肾脏结构在缺血再灌注6小时时出现明显的小管损伤,而再灌注3天和7天时虽然肾功能已完全恢复但仍见少量小管未完全恢复正常。血浆mi R-192水平在IRI 3h时开始升高,IRI12h时达峰值,IRI 24h略有下降,但仍显著高于假手术组,IRI 3d时恢复至基线水平;肾脏mi R-192在IRI 6h时开始显著低于对照组,且在IRI 7d内持续维持低水平表达。血浆和肾组织mi R-192水平变化趋势基本与肾脏结构和功能损伤的趋势基本一致。3.双荧光素酶报告系统证实mi R-192通过与BLCAP 3’UTR保守位点39-62nt结合,mi R-192 mimic可以降低BLCAP蛋白的表达,而mi R-192 inhibitor可以上调BLCAP蛋白的表达。IRI大鼠肾组织内及H/R刺激后NRK52E细胞内BLCAP蛋白表达升高。4.NRK52E细胞在H/R刺激后细胞活性显著降低,停滞在G0/G1期的细胞显著增加,细胞凋亡显著增加,而mi R-192的水平显著低于常氧组。在常氧条件下,敲减BLCAP组G0/G1期的细胞较未敲减组显著减少,而S期的细胞显著增多,且细胞周期相关基因CDK2、CKD4、CCNA2、CCND1、CCND3等表达上调。而在低氧条件下敲减BLCAP后可以显著改善H/R诱导的细胞活性下降,细胞周期停滞及且细胞凋亡等。【结论】:大鼠肾脏急性缺血再灌注损伤后血浆和肾组织mi RNA表达谱发生显著改变,其中血浆mi R-192表达水平显著升高而肾组织mi R-192表达下降,且呈时间依赖性。mi R-192通过作用于BLCAP调节肾小管细胞增殖周期而参与缺血再灌注性肾损伤。