适配体修饰壳聚糖磁纳米粒子的制备及其在赭曲霉毒素A检测中的应用

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赭曲霉毒素A(OTA)是由曲霉属和青霉属真菌产生的一种真菌毒素,具有致癌、致畸、致变的作用。食品及饲料中OTA的污染,不仅造成严重的经济损失,且对人和动物的健康造成巨大的危害。各国对农产品中OTA残留设定了严格的限量标准,迫切需要建立快速、高效、灵敏的样品前处理及OTA分析检测技术。本研究将壳聚糖磁性纳米粒子(Fe3O4@CTS)与OTA特异性核酸适配体(Aptamer)偶联制备获得一种新型磁性吸附剂(Fe3O4@CTS@Apt),并对其理化性能和应用前景进行了表征和评价,主要研究内容和结果如下:(1)采用化学共沉淀法成功制备了Fe3O4磁性纳米粒子,并通过单因素优化,确定Fe2+与Fe3+摩尔比为1:1.5,反应pH为10.0,反应温度50°C,熟化温度为70°C,表面活性剂PEG含量为30 mL;采用乳化交联法将壳聚糖包被在最优条件下制备出的Fe3O4磁性纳米粒子表面,并通过单因素实验确定最佳包被条件:壳聚糖浓度为1.5%,壳聚糖与Fe3O4质量比为1:1,液体石蜡含量为80 mL,戊二醛含量为10 mL,搅拌速度为1200 rpm。对所制备出的Fe3O4及Fe3O4@CTS磁性纳米粒子进行扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)、傅里叶红外(FT-IR)、X-射线衍射(XRD)、热重分析(TGA)、磁滞回线分析(VSM)等表征,确定壳聚糖已成功包被在Fe3O4表面。(2)采用EDC/sulfo-NHS法,将适配体共价偶联在Fe3O4@CTS磁性纳米粒子表面,其偶联率达到96.0%,其最大偶联量为19.2 OD Apt/g,且制得的适配体修饰的壳聚糖磁性纳米粒子可在4°C下稳定保存30天。(3)对制备出的Fe3O4@CTS@Apt磁性纳米粒子进行表征鉴定,结果显示其最大吸附量为127.2 ng OTA/g;对不同浓度的OTA标准溶液进行重复性检测,回收率为95.0%108.0%,不同批次之间(batch-to-batch)相对标准偏差(RSD)为5.0%,具有较好的重复性,且不存在非特异性吸附。(4)对Fe3O4@CTS@Apt磁性纳米粒子的吸附和解吸条件进行优化,确定吸附缓冲液为10%甲醇-Tris-chloride buffer(10 mM Tris、120 mM NaCl、5 mM KCl and 20 mM CaCl2),吸附时间为2 min,选择甲醇/Tris-EDTA buffer/HCl=70/28/2(v/v/v)为解吸缓冲液,解吸体积为3 mL,解吸时间为5 s。(5)将Fe3O4@CTS@Apt磁性吸附剂用于实际样品加标回收(加标浓度为5μg/kg、10μg/kg),其回收率为91.3%99.1%,RSD?4.2%,而免疫亲和柱的回收率为97.1%111.3%,RSD?4.2%,二者结果无明显差异,但磁分离所需的时间远短于免疫亲和层析法所需的时间。
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