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我国地方黄牛具有独特的基因资源,如何从遗传学和表观遗传学的角度来阐释肉用性状形成的原因及其分子调控机制,将成为我国黄牛遗传改良工作的研究重点。本研究以中国黄牛作为研究对象,利用甲基化DNA免疫共沉淀测序(MeDIP-Seq)、亚硫酸氢盐测序PCR(BSP)、结合重亚硫酸盐处理和酶切分析(COBRA)、实时荧光定量PCR(QPCR)、蛋白质免疫印迹(Western blot)、DNA池测序、Forced-PCR-RFLP、基因克隆、细胞培养、腺病毒的包装以及真核表达等现代生物技术进行了两个方面的试验研究:第一,研究了秦川牛胎牛和成年时期的背部肌肉组织的全基因组DNA甲基化修饰图谱,筛选出甲基化和表达差异显著的基因及其作用的信号通路;第二,研究了与肌肉生长发育相关基因(ZBED6及其靶基因IGF2)的遗传变异及其对黄牛生长性状的转录调控的影响,分析了其组织表达谱、启动子活性、甲基化水平,以及在细胞水平上的表观转录调控功能。主要研究内容和结果如下:1、黄牛肌肉生长发育相关甲基化基因的筛选及其功能鉴定(1)MeDIP-Seq分析牛肌肉组织的全基因组甲基化图谱:首次绘制出牛2个关键生长发育时期(胎牛和成年牛)肌肉组织全基因组水平的DNA甲基化图谱,发现两组样品测序Reads在每条染色体的尾端富集程度高于其他区域,高甲基化区域的长度主要集中在900~1000bp,大多含有10~15个CpG,高甲基化区域在5’非翻译区(5’UTR)和编码区(CDS)基因元件上覆盖度(即覆盖碱基数与该区域碱基总数的比值)最高。(2)样品间各表达水平基因在基因及附近区域的甲基化修饰分布趋势:成年牛在基因内及其上下游2kb区域的整体DNA甲基化水平高于胎牛,不同表达水平基因的DNA甲基化水平不同,基因的表达水平和其对应的DNA甲基化修饰程度呈负相关,即基因的mRNA表达水平越高,其DNA甲基化水平越低,反之亦然。特别是基因的转录起始位点最为明显。(3)样品间全基因组表达差异基因和甲基化差异基因统计:表达水平上调基因有1,885个,下调基因有4,889个;启动子(Promoter)区域甲基化水平上调基因有235个,下调基因有143个,该区域甲基化和表达水平负相关的基因共有77个。基因体(Genebody)区域甲基化水平上调基因有3,504个,下调基因有2,313个,该区域甲基化和表达水平负相关的基因有1054个。(4)样品间全基因组甲基化差异基因的GO功能显著性富集分析:在Promoter区143个下调基因的分子功能分类中,有1项显著富集条目,其功能都与甲基转移酶活性相关。在基因CDS区1076个上调基因的分子功能分类中,有9项显著富集条目,其中大部分功能都与核苷酸结合和磷酸酶调节活性相关;792个下调基因的分子功能分类中,有8项显著富集条目,其中大部分功能都与核苷酸结合和运输活性相关;在生物过程分类中,大部分功能都与甲基转移酶活性相关,有1项显著富集条目是移动。(5)样品间全基因组甲基化差异基因的通路(Pathway)显著性富集分析:在Promoter区,下调基因参与的通路有93个,上调基因参与的通路有143个,均无显著富集的通路;在CDS区,下调基因参与的通路有195个,显著富集的通路是粘着斑,有34个下调基因显著富集到该通路;上调基因参与的通路有209个;无显著富集的通路。(6)样品间全基因组表达和甲基化负相关基因的GO功能显著性富集分析:两组样品在基因Promoter和Gene body区域负相关基因都没有显著富集的GO项。(7)样品间全基因组表达和甲基化负相关基因的通路(Pathway)分析:在Promoter区,77个负相关基因参与的通路有81个,显著性富集通路有2个,分别是柠檬酸循环和轴突导向。在Gene body区,1054个负相关基因参与的通路有204个,显著性富集通路有3个,分别是紧密连接,调节肌动蛋白细胞骨架和维生素的消化和吸收。(8)样品间全基因组启动子区表达和甲基化负相关基因的定量验证分析:利用QPCR技术在秦川牛3个不同发育时期9种不同组织中,对启动子区负相关的48个基因进行了表达谱分析,其中有45个基因的定量验证结果和甲基化测序结果一致。2、黄牛IGF2和ZBED6基因mRNA表达及其与DNA甲基化水平相关性研究利用QPCR、BSP和COBRA分析发现:牛IGF2和ZBED6基因在2个发育时期6中组织中mRNA表达量和甲基化水平呈现负相关,以胎牛时期的表达量和甲基化水平为对照组,ZBED6在肝脏、肺脏和脾脏的mRNA表达量均有所上升,而DNA甲基化水平均有所下降;IGF2在肌肉、心脏、肺脏和脾脏的表达量均有所下降,而甲基化水平均有所上升。3、黄牛IGF2和ZBED6基因SNPs检测及其与生长性状的效应分析本研究利用DNA池测序分析结果发现:在IGF2基因内含子8区域发现4处非编码突变,分别命名为IVS8-17G>A,-220C>T,-221A>G和-1393A>G。在ZBED6基因上游区域发现1处非编码突变和编码区发现2处错义突变,分别命名为-826G>A,680C>G和1043A>G;关联分析结果显示:在南阳牛和郏县红牛群体中,不同基因型对5个关键生长发育时期的体重显著相关;在秦川牛群体中,不同基因型与成年基础母牛的10项体尺和体重指标性状显著相关;两个基因的突变型个体大于野生型个体(P<0.01或者P<0.05)。4、转录因子ZBED6对IGF2基因转录活性及调控特征的研究(1)生物信息学分析结果显示,在ZBED6基因启动子突变型M-826A的序列上,发现一个新结合的转录因子PLZF,PLZF可能作为抑制因子参与了抑制ZBED6的转录活性,而参与上调动物机体的造血功能,脂肪和肌肉细胞增殖及分化过程。(2)双荧光素酶检测系统的检测结果显示:在启动子-866bp到-556bp位置之间的片段活性最高,野生型M-826G-pGL3的启动子活性显著高于突变型。IGF2基因IVS3-3106G>A突变后的3个不同长度片段的启动子序列的活性显著上调,其中长度为439bp启动子截短体序列的活性最强;过表达ZBED6基因对IGF2基因的启动子活性有极显著的下调作用。(3)QPCR分析结果显示:ZBED6基因编码区发生突变的单倍型个体在秦川牛肌肉组织中的mRNA表达量显著下降,IGF2基因mRNA表达量显著上升。在体外培养的C2C12细胞中,过表达ZBED6可引起IGF2基因mRNA表达量显著上升。以上结果可知,转录因子ZBED6可与IGF2基因内含子3区域突变位点(3106A)附近的序列结合来发挥其对IGF2基因转录活性的抑制调控功能。5、抑制因子ZBED6基因腺病毒干扰载体的构建及其功能研究筛选出具有明显干扰效果的shRNA(pENTR/CMV-GFP/U6-shRNA-906)并进行了病毒重组和包装;重组的腺病毒干扰载体感染牛原代肌肉细胞,QPCR、半定量PCR和Western blot的检测结果显示,ZBED6表达量下调,IGF2基因表达量明显上调,揭示了干扰转录因子ZBED6,可失去其对IGF2基因的抑制作用。6、抑制因子ZBED6基因腺病毒过表达载体的构建及其功能研究构建了牛Ad-ZBED6重组腺病毒超表达载体;包装和扩繁得到高滴度的超表达腺病毒;重组的过表达腺病毒Ad-ZBED6感染牛原代肌肉细胞,QPCR、半定量PCR和Westernblot的检测结果显示,ZBED6表达量上调,IGF2基因表达量明显下调,揭示了过表达转录因子ZBED6可增加其对IGF2基因的抑制作用。以上的研究结果显示,在黄牛不同发育时期的肌肉组织中存在大量DNA甲基化修饰和mRNA表达差异的基因,这些差异基因主要与肌肉细胞的生长分化和代谢相关;在细胞、个体和群体水平上鉴定了与肌肉生长发育相关的功能基因ZBED6及其靶基因IGF2,研究这两个关键基因在转录前、转录后和翻译过程中的相互调控作用,从而系统地从遗传和表观遗传调控等方面揭示与肌肉生长发育相关基因的功能与分子调控机制,这不仅对全方位阐明黄牛肉用性状遗传和调控的分子机理具有重要科学意义,而且为黄牛肉用选育和高效生产提供科学理论依据。