骨肉瘤是好发青少年的恶性肿瘤,预后差。该肿瘤病理特征复杂,术前活检取材局限,需要充分结合临床和影像学征象,因此长期以来其病理诊断为日常工作中的难点。骨肉瘤的临床病理特点和预后相关因素需要更多的总结和探讨。骨肉瘤的致死率高,肺转移是常见进程。采用保肢及新辅助化疗使骨肉瘤患者的预后有所改善,但30年来其生存率没有突破,处于停滞状态,迫切需要开发新的早期诊断标记物和新的治疗靶点,而针对骨肉瘤有效的治疗取决于我们对其侵袭和转移机制的认识,因此探讨骨肉瘤侵袭和转移的机制仍然是目前研究的热点和难点问题。Notch信号通路是重要的发育信号通路,其异常表达促进肿瘤发生。Notch信号作为关键因素参与了骨肉瘤的发生和发展。探讨Notch通路对骨肉瘤生物学行为的影响及分子机制,不仅有助于阐明骨肉瘤侵袭和转移的分子机制,也为骨肉瘤的诊断和个性化治疗提供新靶点和新策略,即Notch有望成为治疗骨肉瘤的突破口。其中Notch3的表达对骨肉瘤预后的影响、对骨肉瘤细胞的作用及机制未见报道。因此,本课题共分为以下两个部分:第一部分对70例骨肉瘤进行了临床病理学的回顾性研究,全部病例进行了组织病理学观察和EnVision法免疫组织化学染色,选用的抗体有Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Jagged1、Jagged2、DLL4、CD133、Nanog、SOX2。5例进行了电镜观察。对56例随访资料完整的病例进行了生存分析和预后相关因素统计学分析。对Notch3阳性组和阴性组病例进行了比较,并分析了肺转移病例的临床病理特点。旨在明确骨肉瘤的临床病理特点和预后相关因素,及Notch3对骨肉瘤转移的影响。第二部分敲低骨肉瘤细胞系U2OS和MTH的Notch3基因表达后,CCK8实验检测细胞增殖速率,流式细胞术检测细胞周期,划痕实验和Boyden chamber侵袭实验检测迁移侵袭能力,qRT-PCR和western blot方法检测其下游效应分子Hes1和侵袭转移相关蛋白水解酶MMP的表达,动物实验检测裸鼠骨肉瘤肺转移能力,旨在明确Notch3对骨肉瘤细胞侵袭转移的作用及途径。主要实验结果及结论如下:第一部分1.临床表现:病人以青少年为主,男女比例3:2。平均年龄25.1岁,中位年龄41岁;70%(49/70例)的患者发病部位为股骨和胫骨,95.7%(67/70例)的患者就诊时处于临床Ⅱ~Ⅲ期,82.9%(58/70例)的患者以疼痛为主要症状,66.1%(39/59例)的患者血碱性磷酸酶升高。2.影像学表现:87.1%(61/70例)的病例示骨质破坏,11.4%(8/70例)示髓腔累及,41.4%(29/70例)示骨皮质累及,40%(28/70例)示骨膜反应。3.组织病理学:(1)57.1%(40/70例)见浸润性生长,包括宿主骨浸润10例(髓内和/或骨皮质浸润)和软组织浸润30例。(2)70例均见恶性肉瘤性肿瘤细胞。3例肿瘤细胞异型性较小(包括2例髓内高分化骨肉瘤和1例骨旁骨肉瘤)。(3)70例均可见肉瘤细胞直接形成的肿瘤性骨样组织,粗细及数量不等。(4)本组病例中普通型骨肉瘤占88.6%。4.活检方式对诊断的影响:穿刺活检、术中冰冻、切开活检/病灶刮除/瘤段切除骨肉瘤诊断率分别为60%,58.6%和100%。5.免疫表型:受体Notch1、Notch2、Notch3、Notch4表达率分别为87.1(61/70)、33.9%(23/70)、68.6%(48/70)、91.4%(64/70)。配体Jagged1、Jagged2、DLL4表达率分别为87.1%(61/70)、84.3%(59/70)、88.6%(62/70)。干性标记CD133、Nanog、SOX2表达率分别为97.1%(68/70)、10%(7/70)、4.3%(3/70)。6.超微结构:胞浆内溶酶体、线粒体、粗面内质网丰富,并含高电子密度的物质。细胞间可见胶原纤维和羟磷灰石结晶沉积。7.治疗及生存分析:60%(42/70例)的患者接受了化疗,95.7%(67/70例)的患者进行了手术。54例有随访资料的患者中位生存时间18月,平均生存时间41.7月。1年、2年和5年生存率分别为87%、66%和30%。对数秩检验(Log-rank test)分析示Enneking分期、术前化疗、Notch3表达与预后相关,Cox比例风险回归模型分析Enneking分期、术前化疗、Notch3表达是该肿瘤的独立预后因素。8.Notch3阳性与阴性病例临床特征比较:两组有无血碱性磷酸酶升高、有无转移具有统计学差异。9.肺转移病例特点:17例肺转移病例男女之比为2.4:1,平均年龄24岁,中位年龄17岁。70.6%(12/17)肿瘤细胞表达Notch3。17例中16例有随访资料,16例患者生存时间2~27月,中位生存时间12.5月,平均生存时间17.1月。1年、2年和5年生存率分别为54.0%、22.0%和0%。结论骨肉瘤好发于青少年,男性多,疼痛为主要症状。骨质破坏为最常见的影像学征象。普通型骨肉瘤占骨肉瘤的88.6%,浸润性生长、肉瘤细胞和肿瘤性骨组织为3个重要组织学特点。Notch3的表达率为68.6%。本组病例5年生存率低。Enneking分期、术前化疗、Notch3表达是该肿瘤的预后因素。第二部分1.利用慢病毒转染敲低U2OS和MTH细胞系Notch3的表达。2.敲低Notch3的表达后,骨肉瘤细胞系U2OS和MTH的增殖速率降低,细胞周期出现G1期阻滞。3.敲低Notch3的表达后,骨肉瘤细胞系U2OS和MTH的迁移和侵袭能力下降。4.敲低Notch3的表达后,骨肉瘤细胞系U2OS和MTH中Hes1和MMP7的表达在mRNA和蛋白水平下降。5.利用RNA小干扰敲低Hes1的表达。6.敲低Hes1的表达后,骨肉瘤细胞系U2OS和MTH中MMP7的表达下降。7.敲低Notch3后,MTH组裸鼠肺转移率、转移灶数量下降。Notch3敲低组裸鼠转移灶中Notch3、Hes1、MMP7的mRNA降低。结论Notch3的表达促进骨肉瘤的侵袭转移,且Notch3通过下游效应因子Hes1调控侵袭转移相关蛋白MMP7而影响骨肉瘤细胞的侵袭转移。