巨噬细胞是机体免疫系统的重要组成部分,也是病毒感染的靶细胞之一,其表面分子多种多样,研究其表面分子的相互作用对研究病毒有非常重大的意义,为了探讨马传染病病毒与巨噬细胞的免疫相互作用,制备具有特异性识别蛋白的单克隆抗体就显得尤为重要。其中CD63是巨噬细胞的表面蛋白,也是四跨膜蛋白家族的一员,其本身具有四个结构域,共717个碱基,编码239个氨基酸,其理论分子量为25.6kDA,经信号肽分析网站分析,该区并无信号肽,且具有四次跨膜结构。已经证实该蛋白在HIV-1在人巨噬细胞中的复制具有重要作用,且在人黑色素瘤中CD63起着肿瘤抑制的作用。本研究为获得特异性的马CD63单克隆抗体,通过原核以及真核表达系统表达和纯化CD63蛋白,并通过DNA免疫方式免疫动物,刺激其产生免疫应答反应,最终制备出CD63特异性的单克隆抗体。在研究过程中发现CD63全长无法在体外获得表达,经跨膜区软件分析后,去掉跨膜区的序列,选取CD63序列297个碱基的胞外区(截短的CD63)进行原核表达,经条件优化后成功获得可溶性的蛋白,但因蛋白表达量少导致纯化困难。进一步采用了真核表达的方式,重组质粒构建的策略是将具有诱导蛋白分泌的信号肽和His标签序列分别插入到目的基因的前面和后面,并连接至VR1012载体,将获得的阳性重组质粒转染293T细胞,待48h后收集细胞和上清液,经免疫印迹(Western blotting)分析,成功获得了可溶性表达的CD63蛋白。为了提高蛋白纯化的特异性,选择在转染后6小时更换无血清培养基,通过His标签进行纯化,获得了较纯的CD63蛋白。DNA免疫动物时,将表达CD63蛋白的重组表达载体通过肌肉注射的方式注入小鼠体内,使小鼠发生免疫应答反应,取血清检测中效价高的动物进行加强免疫,加强免疫三天后采用眼球采血处死的方法处死小鼠,取小鼠脾脏与骨髓瘤细胞进行融合,筛选出特异性识别马CD63的单克隆抗体。特异性的单克隆抗体对于分析分子间相互作用有着至关重要的作用,马CD63单克隆抗体的制备对于研究马CD63分子发挥免疫保护机制的研究奠定了基础,也为研究马CD63与病毒相互作用的分子机制提供了有效工具。