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第一部分：Tbet对小鼠巨噬细胞(Raw264.7)生物学活性影响的研究
1.研究背景与目的Tbet是一种特异性调控Th1淋巴细胞的核转录因子，它广泛调控多种免疫细胞(如Th1、NK、CD8+、DC、B细胞等)的生物学活性。迄今为止，有关Tbet对巨噬细胞生物学影响的相关报道较少。本研究利用真核表达载体(pcDNA3.0)携带小鼠Tbet基因(pcDNA3.0-mTbet)瞬时转染入小鼠巨噬细胞(Raw264.7)，探讨对其可能的生物学作用。
2.实验方法构建含Tbet的真核表达载体pcDNA3.0-mTbet，通过双酶切鉴定及测序、PCR鉴定其准确性，RT-PCR及Westernblot检测其在Raw264.7中的表达。以PBS、pcDNA3.0空载体作为对照，将其瞬时转染入Raw264.7，48h后观察它们对该细胞的细胞周期、细胞表面分子MHCⅠ/Ⅱ、CD80、CD86的表达、对FITC-右旋糖酐(FITC-Dextran)的吞噬能力、一氧化氮(nitricoxide，NO)的分泌水平及对小鼠白血病细胞株L1210杀伤活性的影晌。
3.结果载体pcDNA3.0-mTbet构建成功并在Raw264.7中顺利表达；Tbet对Raw264.7的细胞周期无影响(P＞0.05)；经Tbet修饰后，细胞表面MHCⅠ类分子的表达强度(24.8±0.6)高于空载体组(20.8±0.7)，有统计学差异(P＜0.05)；但两组之间MHCⅡ、CD80、CD86类分子的表达无差异(P＞0.05)。Tbet修饰组吞噬Dextran的平均荧光强度(32.8±0.8)高于空载体组(28.2±0.4)，此结果有统计学差异(P＜0.05)。Tbet组在无脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激时NO的产生量(1.7±0.60pmol)高于空载体组(0pmol)；经LPS(10μg/ml)持续刺激20h后，Tbet组NO的产生(15.6±1.6pmol)高于空载体组(10.5±1.3pmol)，有统计学差异(P＜0.05)。Tbet组对L1210的体外杀伤活性(51.9±3.5％)是空载体组(35.6±2.1％)的1.5倍，统计学差异显著(P＜0.05)。
4.结论Tbet对小鼠巨噬细胞Raw264.7的生物学功能具有一定影响，它可诱导Raw264.7表达MHCⅠ类分子，增强其对Dextran的吞噬能力，促进其分泌NO并增加其对L1210细胞的杀伤活性；但是它对该细胞的细胞周期及MHCⅡ、CD80、CD86类分子的表达无影响。
第二部分：应用pcDNA3.0-mTbet对小鼠黑色素瘤进行免疫治疗的探讨
摘要1.研究背景与目的Tbet是一种特异性调控Th1淋巴细胞的核转录因子，它广泛调控多种免疫细胞(如Th1、NK、CD8+、DC、B细胞等)的生物学活性。在肿瘤的发生及发展过程中，Th2性细胞因子往往占主导，巨噬细胞、NK、DC、CD8+、CD4+等免疫细胞的功能在一定程度上处于抑制状态。因此，重新恢复机体内Th1/Th2细胞的平衡、激活受抑制的免疫细胞、打破机体的免疫无能状态成为非常有前途的免疫治疗手段。黑色素瘤是一种起源于黑色素细胞的高度恶性肿瘤，易发生远处转移，疗效及预后均较差。免疫治疗是继手术、化疗、放疗后的一种充满希望的治疗手段。本研究利用真核表达载体(pcDNA3.0)携带小鼠Tbet基因(pcDNA3.0-mTbet)分别从体内、外的角度对小鼠黑色素瘤的免疫治疗进行探讨。
2.实验方法我们以PBS、空载体pcDNA3.0作为对照，将pcDNA3.0-mTbet瞬时转染入小鼠黑色素瘤细胞(B16)中，运用RT-PCR及Westernblot的方法证实其在该细胞中成功表达；转染48h后，流式细胞仪检测其细胞周期及细胞表面分子MHCⅠ/Ⅱ、CD80、CD86表达的改变；构建C57BL/6-B16动物模型，以生理盐水及空载体(pcDNA3.0)作为对照，分别于接瘤后的第7、10、13天瘤内注射LipofectamineTM包裹的pcDNA3.0/pcDNA3.0-mTbet质粒，观察各组小鼠生存率的改变；RT-PCR法检测pcDNA3.0-mTbet在瘤内的动态表达；ELISA法检测各组血清中IFN-γ及IL-4的含量。
3.结果真核表达载体pcDNA3.0-mTbet在B16细胞中成功表达；Tbet对B16细胞的细胞周期及其表面分子MHCⅠ/Ⅱ、CD80、CD86的表达无影响；pcDNA3.0-mTbet在瘤体内的表达于末次注射后第7天达到最高，从第9天开始下降，至第15天仍有较弱表达；在同一时间点，Tbet组的生存率高于空载体组，但无统计学差异；Tbet组小鼠血清中IFN-γ的量(28.7±4.3pg/ml)明显高于空载体组(18.6±4.2pg/ml)，统计学差异显著(P＜0.01)；Tbet组小鼠血清中IL-4的含量(23.7±2.3pg/ml)与空载体组(22.8±2.7pg/ml)相比无明显差异(P＞0.05)。
4.结论pcDNA3.0-mTbet对B16细胞的细胞周期及其表面抗原分子MHCⅠ/Ⅱ、CD80、CD86的表达无影响；它可显著增加体内IFN-γ的分泌。Tbet对小鼠黑色素瘤无明显的免疫治疗作用，但对生存期有一定的影响，此结果可能与IFN-γ的表达上调有关。