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云芝糖肽(PSP)是从云芝发酵菌丝体中提取的结合蛋白多糖,临床上用于增强肿瘤病人的免疫功能。近年发现它还能直接通过干扰细胞周期、诱导凋亡等机制抑制、杀伤多种癌细胞。本实验室前期研究发现PSP诱导Molt-4等白血病细胞死亡过程中形态除发生典型凋亡样固缩改变外,还有体积膨大现象,提示可能有其它死亡机制存在,因此本研究进一步进行了探讨。研究用显微测量术测量了PSP引起的Molt-4细胞直径变化。结果显示,20、40、80μg/mL PSP可分别使细胞平均直径从正常的10.80±1.40μm增加到12.12±2.06、13.01±2.63和13.81±2.52μm(P<0.01)。流式细胞术前散射信号分析发现细胞大小有增加和缩小两种不同的变化。细胞与PSP(20、40、80μg/mL)分别孵育48h后用caspase-1荧光抑制剂FLICA标记,再用流式细胞术分析FLICA阳性细胞比率,发现由对照组的2.38%分别增加到4.57、5.25、16.40%(P<0.05)。用PSP作用12、24、36、48h后再同样检测,发现FLICA阳性细胞比率从对照组的3.2%分别增加到8.65、12.4、18.6和22.8%(P<0.001)。这些结果提示PSP可浓度和时间依赖性激活Molt-4细胞中的caspase-1。VX-765、Ac-YVAD-CMK等caspase-1抑制剂在25-100μM浓度范围内不但不能抑制PSP诱导的caspase-1激活及细胞死亡,还显示出明显的细胞毒性。采用流式细胞分析法,用Gating技术分析FLICA阳性细胞(FLICA+)在前散射(FS)/侧散射(SS)信号散点图上的分布,发现FS信号强(体积较大)的细胞百分率随PSP(80μg/mL)作用时间延长,由对照组的4.71%分别增加到29.8%(12h)、34.7%(24h)、46.2%(36h)、30.0%(P<0.01)(48h)。FS信号弱的较小的细胞百分率虽然也有增加(9.51、13.3、17.1、24.4%,P<0.001),但显微镜观察发现细胞出现空泡,有FLICA标记的胞质边缘化推断由此变化造成FS信号减弱,而非体积变化所致。细胞用FLICA、7-AAD和Annexin V-APC三种试剂同时进行标记,流式细胞检测,Gating选取7-AAD阴性的完整细胞,发现随PSP浓度和作用时间的增加,细胞出现Annexin V阳性、FLICA阴性(Ann+/FLICA-)的细胞和FLICA阳性、Annexin V阴性(Ann-/FLICA+)的细胞及Ann+/FLICA+的细胞三种不同变化,提示有部分细胞(Ann+/FLICA-)发生早期凋亡,部分细胞发生caspase-1相关的死亡(Ann-/FLICA+),且这种死亡机制与凋亡有关(Ann+/FLICA+)。时序研究发现Ann-/FLICA+的细胞先出现在前,Ann+/FLICA+的细胞出现在后,提示caspase-1相关的细胞死亡机制可转为凋亡。流式细胞术进一步分析发现,Ann-/FLICA+的细胞FS信号强,细胞具有较大的体积,而Ann+/FLICA+的细胞FS信号弱,也提示细胞体积增大和caspase-1激活是细胞死亡过程中早期的事件。caspase-1参与的细胞死亡过程通常伴随IL-1β和IL-18的产生,因此用实时定量PCR方法分析了PSP诱导的Molt-4中IL-1β和IL-18基因表达水平。以GADPH基因为内参,发现20,40,80μg/mL PSP可浓度及时间依赖地上调IL-1β和IL-18基因表达。IL-1β最高被上调2.9倍(80μg/mL,12h),IL-18上升了14.5倍(80μg/mL,24h)。采用DCFH-DA试剂标记细胞内的活性氧簇(ROS)产生,发现20、40、80μg/mL PSP可使ROS阳性细胞相对荧光强度上调1.2、2.7、3.2倍。综上所述,PSP除能诱导凋亡外,还可使细胞体积发生膨大、激活caspase-1、上调IL-1β、IL-18基因的表达。这种机制可能为焦亡。