柴油食烷菌AlcanivoraxdieseloleiB-5T是本课题组分离鉴定的一株重要的石油降解菌，具有潜在的环境意义和生物学意义。实验发现柴油食烷菌B-5能够利用多种卤代烷烃为唯一的碳源和能量来源进行生长。　　1.柴油食烷菌B-5中的HLDs基因克隆表达与酶学特性分析　　本文中表达、纯化了柴油食烷菌B-5中的两个推定的HLDs，DadA和DadB;检测了这两个酶的底物范围和酶活特性;测定了DadB的稳态动力学常数、最适温度和最适pH;使用动态光散射技术分析了DadB在不同pH的溶液中的稳定性;通过同源建模研究了DadB酶学特征的结构学基础。　　DadA在已鉴定的HLDs中具有最严格的底物选择性，其底物范围明显小于其他已鉴定的HLDs，代表了一个新的酶活特异性亚家族。DadB表达纯化简单高效，具有宽广的底物范围和很高的催化活性，偏爱小分子（C2和C3）底物、溴代底物和氯代烯烃底物，其对不同程度的氯代、溴代、碘代的C2和C3链长的底物的整体酶活是目前已知的HLDs中最高的。DadB对6个卤代底物的稳态动力学常数基本与其他HLDs处于相近的数量级，对3-氯-2-甲基丙烯、4-溴丁腈等多个底物具有较高的转化数Kcat。另外，4-溴丁腈脱溴对DadB具有明显的底物自抑制效果。　　DadB酶活稳定性好。DadB在pH5.0到pH10.0范围内都有明显的活性，最高活性出现在pH8.0处，且在pH8.0-9.0范围内变动不大。DadB在20℃到55℃温度范围内都有酶活，最适温度为50℃。缓冲液pH低于7.5时，DadB易聚集形成不同聚合程度的聚合物。当缓冲液pH≥7.5时，DadB在溶液中以单体形式存在，能保持长时间的结构稳定。　　对DadA和DadB进行同源建模，发现二者采用典型的α,β-水解酶折叠方式，由核心结构域和帽子结构域两部分组成。DadA、DadB的催化五联体、活性位点的拓扑结构与已解析结构的HLDs基本一致。但是DadB具有更大的活性位点进出通道的开口，同时在阻隔主进出通道和狭槽通道的壁垒处采用Ile/Trp的组合，这可能是DadB偏爱小分子底物的重要原因。　　2.HLDs的系统进化分析　　本文对总共37株食烷菌基因组进行了分析，发现其中33株食烷菌中含有一共51条推定的HLDs序列。对食烷菌属中的HLDs序列进行系统发育分析，发现食烷菌属在不同的时间点通过至少4次相对独立的进化事件从其他种属中得到了不同的HLDs进化分支，随后这些HLDs可能还通过基因水平转移在食烷菌属内不同菌株之间进行了传递。　　本文还对目前几乎所有的HLDs进行了整体的系统发育研究。使用已鉴定的17条HLDs序列进行搜索，运用生物信息学技术从NCBI的nr数据库中一共找出421条推定的HLDs序列，加入本课题组获得的53条HLDs序列后进行系统发育分析，发现DadA及另外19条全部来自于食烷菌中的HLDs代表了HLDs家族的一个新的进化分支，这与DadA具有独特的酶活特性的现象相一致。本文对HLDs家族的天然功能及其对微生物和环境的重要作用进行了初步分析，提出海洋环境可能是HLDs序列的一大遗传资源库，并对HLDs的传播和进化起了重要作用。　　总之，本文第一次证明了食烷菌属存在具有脱卤活性的HLDs，分析了这些HLDs对食烷菌利用卤代烷烃作为唯一碳源进行生长的意义，鉴定得到了具有新奇的底物选择性和序列特异性的DadA和具有宽广的底物范围且对难降解的小分子底物具有目前已鉴定的HLDs中最高酶活的DadB。这些研究拓宽了HLDs遗传资源，为HLDs的实践应用提供了选择目标，为通过蛋白工程改造获得更有催化效率或更好的底物选择性的HLDs的研究提供了材料，并且证明了石油降解菌AdieseloleiB-5还具有卤代污染物降解方面的应用潜力。目前发现推定的HLDs在大约120个属中存在，本文以食烷菌属作为优良的模型系统，第一次对某一个种属内的HLDs的来源、进化、传递、扩散等事件进行了分析，对揭示HLDs的天然功能、探讨HLDs在如此之多的不同种属中分布的可能原因、研究HLDs对物种代谢及生存的作用和意义提供了重要的线索和思路。