研究背景神经胶质瘤是成人中枢神经系统中最为常见的原发性恶性肿瘤之一,约占成年恶性原发性脑肿瘤的70%[1]。临床诊疗过程中,除极少数低级别胶质瘤,如毛细胞型星形细胞瘤,通过显微镜下肿瘤全切手术治愈外,大部分恶性胶质瘤患者生存期仍比较短,统计表明中位生存期约为14个月[2、3]。近些年来,随着医学技术发展,对恶性胶质瘤患者进行手术、化疗、放疗等综合治疗,取得了很大的进步,但难以避免复发,只有大约5%的患者生存期超过5年,总体预后仍然很差[4]。探寻有效抑制胶质瘤细胞生长、侵袭的方法,延长患者生存时间、改善患者生存状态是当今神经科学亟待解决的问题。因此,迫切需要我们从基因及分子水平上,对神经胶质瘤的生物学行为进行深入研究,以期待找到对恶性肿瘤更有效的治疗方法和途径。三结构域(tripartite motif,TRIM)家族蛋白,目前发现有70多个成员,是一类具有RBBC结构的蛋白。其成员几乎存在于所有多细胞真核生物中,既往的研究中发现,它们在细胞内信号传导、细胞周期、细胞凋亡、分化、发育代谢以及病毒的免疫应答、自噬和癌症发生等过程中均发挥着重要作用[5、6]。其蛋白结构特征是:N末端结构相对保守,由一个RING结构域(RING-finger domain),一个或两个B-box结构域(B-box domain)和一个卷曲螺旋区结构域(coiled-coil domain)组成[7]。目前为止,在人体中也发现了有8种TRIM蛋白没有RING-finger结构域[8]。TRIM蛋白家族成员的差异在于C-末端的构成,存在着复杂多样性,是人类TRIM家族分类的依据,可分为1 1个亚族(C-I～C-XI)[9]。C末端结构域包括:COS结构域(C-terminal subgroup one signature),纤连蛋白III型重复序列(Fibronectin type Ⅲ,FNIII),PRY结构域,SPRY结构域,细丝蛋白型IG结构域(Filamin-type immunoglobulin,FIL),NHL结构域,植物同源结构域(Plant homeodomain domain,PHD),溴功能区结构域(Bromo-domain),Meprin与TRAF同源结构域(Meperin and TRAF homology,MATH),ADP-核糖基化因子家族结构域(ADP-ribosylation factor,ARF)和跨膜区(Transmembrane,TM)等。其中ARF结构域是由SPRY/PRY结构域融合而形成的B30.2结构域,出现在超过30种TRIM家族蛋白中,可与多种蛋白相互作用[10]。三结构域(TRIM)家族蛋白,因为含有RING-finer结构域,所以其中大多数具有E3泛素连接酶活性,可作为E3泛素连接酶泛素化修饰其它蛋白,从而经蛋白酶体途径使被标记蛋白降解[11]。在细胞形态维持、信号转导、周期调控、DNA修复、转录调节、蛋白质表达质量控制等过程中,泛素化介导的蛋白降解通路,对维持细胞功能稳定发挥了重要的作用。在肿瘤的发生和发展过程中,研究发现其泛素化修饰可以对很多癌蛋白和抑癌蛋白进行调节[12]。例如,TRIM15,TRIM25,TRIM29,TRIM44和TRIM59,被证实作为癌基因或肿瘤抑制因子参与了肿瘤进展[13-15]。TRIM37(Tripartite motif-containing protein 37)是TRIM蛋白家族的成员之一,其基因位于染色体17q22-23[16],同样具有E3泛素连接酶活性[17]。在许多肿瘤或疾病中TRIM37蛋白异常表达,研究发现在乳腺癌、肝癌、胰腺癌、直肠癌、肺癌等多种肿瘤组织中的表达显著上调,通过沉默肿瘤抑制因子、改变基因表达、调控信号通路等促进肿瘤的发生和发展[18-22]。文献报道中,证实TRIM37的表达与肿瘤的分期或分级密切相关。在大多数肿瘤中,随着肿瘤的恶性程度增高,TRIM37表达量增加,并且其过表达有效诱导了肿瘤细胞的迁徙和转移。此外,Shin SW等研究报道,TRIM37在外周血单核细胞基因表达谱中被认定为哮喘相关基因,但在哮喘患者中,TRIM37在外周血单核细胞中表达显著下调[23]。Kallij arvi J等报道,TRIM37基因突变导致了一种罕见的以生长发育障碍,心包狭窄,肌肉、肝、脑、眼等多器官发育异常为特征的常染色体隐性遗传病Mulibrey nanism综合征的发生[24-26]。人TRIM37蛋白通过干扰病毒DNA合成,被证实具有强效的抑制HIV1型病毒复制的能力[27]。然而,TRIM37在人类脑胶质瘤发生和进展过程中的表达模式、生物学作用及机制尚不十分清楚,目前为止,国内外相关研究文献鲜有报道。因此,本研究的目的是探寻TRIM37在人神经胶质瘤中的表达及作用,并试图了解其分子生物学机制。在本研究中,我们发现TRIM37在胶质瘤组织和U87胶质瘤细胞系中上调表达,敲低TRIM37基因表达后显著抑制了胶质瘤细胞在体内外的增殖,迁移和侵袭。本课题包括三部分,第一部分:研究TRIM37在人脑胶质瘤组织中的表达情况,随后,在体外通过siRNA转染U87胶质瘤细胞,敲低TRIM37表达,检测对胶质瘤细胞生物学行为的影响。第二部分:构建慢病毒载体,筛选稳定转染细胞,通过裸鼠体内胶质瘤细胞接种实验,在体内水平研究TRIM37对胶质瘤的作用。第三部分:结合前两部分的研究,进一步探求TRIM37对胶质瘤生物学行为影响的分子机制,以期为胶质瘤的靶向基因治疗提供理论基础和实践依据。第一部分:TRIM37在恶性胶质瘤中的表达和对胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭影响的体外研究目的:1.检测TRIM37基因在正常脑组织和恶性胶质瘤组织中的蛋白表达,进一步探讨TRIM37与胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭性的相关性。2.通过siRNA干扰技术,敲低U87胶质瘤细胞中TRIM37基因表达后,是否能够抑制胶质瘤细胞的恶性生物学特征。方法:1.标本收集山东大学齐鲁医院神经外科在2014年6月至2017年9月期间,接受手术治疗的124例原发性脑胶质瘤患者的临床标本。所有纳入本次研究队列的胶质瘤患者均为首次接受胶质瘤手术治疗,术前均未接受放疗、化疗治疗。根据2007年世界卫生组织(WHO)对中枢神经系统肿瘤的分类,其中包括32例低级胶质瘤(Ⅱ级胶质瘤)和92例高级别胶质瘤(38例Ⅲ级胶质瘤和54例Ⅳ级胶质瘤)。所有患者的神经胶质瘤组织学类型和分级均由两位经验丰富的病理科专家鉴定评估。从严重创伤性脑损伤后行减压手术的患者中共收集20份正常脑组织样本,并对其进行检查以确保无脑肿瘤的存在。患者或家属同意患者的组织标本采集及此次研究应用。本研究获得山东大学齐鲁医院伦理委员会同意和批准。2.细胞培养从中国科学院购买人神经胶质瘤U87细胞系细胞,在含有10%FBS,lOOU/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM培养基中,37℃、5%CO2条件下培养箱中培养。将U87神经胶质瘤细胞随机分成三组:空白对照组(未转染的U87胶质瘤细胞),siRNA对照组(转染阴性对照组)和siRNA-TRIM37(靶向TRIM37转染siRNA组)。3.蛋白免疫印迹分析应用Western blot检测TRIM37蛋白在胶质瘤组织中和正常脑组织中的表达水平。采用Western blot分析实验中三组U87神经胶质瘤细胞:空白对照组、siRNA对照组、siRNA-TRIM37组中TRIM37蛋白的表达水平,以评估转染效率;同时以β-actin为内参对照,检测三组U87细胞中Bax、Bcl-2、Cleaved-caspase3,MMP2、MMP9蛋白的表达。4.免疫组织化学分析应用免疫组织化学法检测TRIM37蛋白在不同WHO分级的胶质瘤组织中和正常脑组织中的表达水平,以分析TRIM37蛋白的表达与胶质瘤患者临床病理特征(年龄、性别、WHO分级)之间的关系。5.qRT-PCR技术通过实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR),以β-actin为内参对照,检测在人脑胶质瘤组织和正常脑组织中TRIM37 mRNA的表达水平。6.细胞转染将U87胶质瘤细胞在在37℃、5%C02条件下,含有102%FBS的DMEM培养基中培养。当细胞达到8 0%的融合率时,以Lipofectamine2000辅助,应用靶向TRIM37的siRNA进行细胞转染,并设置乱序阴性对照。通过蛋白质印迹分析验证转染效率。7.细胞增殖测定按照实验设计的分组(空白对照、阴性对照、转染组),将U87胶质瘤细胞以3000个细胞/孔的密度接种在96孔培养板中。分别在24、48、72小时的时间点,应用CCK-8试剂盒,检测靶向TRIM37的siRNA转染后胶质瘤细胞增殖水平变化。8.细胞周期、凋亡分析将U87胶质瘤细胞按照实验设计的分组(空白对照、阴性对照、转染组)培养,应用Annexin V-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒和流式细胞仪,分析靶向TRIM37的siRNA转染后胶质瘤细胞的细胞凋亡和细胞周期的变化。9.细胞迁移和侵袭测定培养生长状态良好的U87胶质瘤细胞,按实验要求分组(空白对照、阴性对照、转染组)情况,应用Transwell小室和铺Matrigel基质胶的小室,检测靶向TRIM37的siRNA转染后胶质瘤细胞的迁移能力和侵袭能力变化。10.统计学分析应用SPSS18.0软件对实验数据进行统计处理,应用Student’s t-检验和单因素方差分析进行数据分析,通过Dunnett’s检验进行数据多重比较,卡方检验进行数据差异显著性分析,P<0.05表示具有统计学意义。数据表示为“平均值±标准差”。结果:1.TRIM37在人脑胶质瘤组织表达上调:应用RT-PCR检测发现,与人正常脑组织比较,胶质瘤组织中TRIM37 mRNA表达显著上调;Western Blot分析表明,胶质瘤组织中TRIM37蛋白表达增高;免疫组化分析显示TRIM37在胶质瘤组织中的表达情况与胶质瘤恶性程度分级密切相关,且胶质恶性程度越高TRIM37表达越丰富。2.TRIM37表达与胶质瘤的临床病理特征关系中,年龄和性别因素,不具有统计学差异(p>0.05);TRIM37表达与胶质瘤WHO分级相关,Ⅲ、Ⅳ级胶质瘤中显著表达,具有统计学意义(p<0.05)。3.靶向TRIM37 siRNA转染的U87胶质瘤细胞增殖能力显著降低,转染72小时后胶质瘤细胞增殖速率较对照组降低55.3%(p<0.05),表明敲低TRIM37基因表达可抑制胶质瘤细胞增殖。4.敲低TRIM37表达后促进U87胶质瘤细胞凋亡。空白对照组和阴性对照组肿瘤细胞凋亡率分别为1.7%和1.9%,而siRNA-TRIM37组肿瘤细胞凋亡率高达32.7%(P<0.01)。同时Western Blot检测发现siRNA-TRIM37组Bax/Bcl-2比率和Cleaved-caspase3表达显著升高,停滞在S期的细胞比例增加(P<0.05)。5.敲低TRIM37表达抑制胶质瘤细胞迁移和侵袭。胶质瘤细胞转染48小时后,Transwell实验表明siRNA-TRIM37组肿瘤细胞迁移、侵袭能力受到明显抑制(P<0.01)。同时,Western Blot检测发现,敲低TRIM37表达的U87胶质瘤细胞中MMP2和MMP9的表达显著降低(P<0.01)。结论:1.胶质瘤组织和U87胶质瘤细胞中TRIM37表达显著上调,且与肿瘤的WHO分级相关。2.敲低TRIM37表达后可抑制胶质瘤细胞的增殖、迁移和侵袭能力,提示TRIM37有希望成为恶性胶质瘤治疗的靶点。第二部分:针对TRN7基因有效RNA慢病毒歌体的构及靶向TRM37基因hRNA慢抑制氨你内胶质瘤生长的研究目的1.设计并构建特异性靶向人TRD7因的咖RNA慢病毒载体,筛选沉默效率最高的一组破体,为进一步体外实验提供可都的实验基础。2在体外环境下,验证靶向TRM37基因的 shRNA慢病毒载体是否可以有效抑制胶质瘤的生长。方法1设计合成hRNA慢病毒载体并进行包装应用公众网设计软件,设计靶向人TRM37的基因序列,分为1#,2#并,3#,共3组,和阴性对照组(NC组),经过测序比对结果无误后,应用工具细胞株HEK9)进行慢病毒包装,提取成功包装的慢病毒颗粒后,进行病毒滴度测则地2应用妯RNA慢病毒载体转染胶质瘤细胞株(U87),测定沉默目的基因效率培养生长状态良好的U7股质瘤细能,校照实验设计分组空自对照(cm0组)阴性对照组(NC12.3x进行RNA性病毒极转染实验,采用qre和 Westem blot的方法检测TRuM7基因的mRNA和蛋白表达水平,判断针对不同靶点的干扰效果,筛选出最有效的1组慢别毒载体。3选稳定转染的U87股质瘤细胞株培养生长状态良好的U7质瘤细胞,狮释细至1000个m,在吟霉素度为0.1g/m1-3phm的范围内进行师选,确定最低项吟得素浓度(1gm1)能在1014天使细胞全部死亡。慢病毒转染细胞24小时后,开始加入嘌呤霉素lpgm)进行选,每3天更换一次票吟筛选液,14天后获得稳定转染纽胞株,续在含哈素浓度为0.1pgm的培养液中培养。4鼠成瘤实验饲养的15只雄性 BALBc-nv棵鼠随机分成三组,每组5只。培养生长状态良好的三组U87胶质瘤细胞,分别为:空白对照组(con组),Nc组,shRNA-TRIM7组。无菌条件下,将细胞制成重悬液,调整细胞浓度为5×10个m1,医用无菌lm注射器抽取0m细胞悬液注射接种于棵鼠左腹股沟皮下裸鼠皮下可见成瘤后,每35天使用游标卡尺测量皮下种植肿的最长径L(mm)和最短径W(mm),计算肿瘤体积的公式为:肿瘤体积v(mm3)(LxW2)2.裸鼠饲养45天后,采用颈椎脱位法处死裸鼠,取瘤称重并记录。结果1选取的3个靶点均对TRM37有沉默效果。 qRT-PCR检测显示,实验组1蒜、2#、3#的mRNA水平沉默效率分别为802%,88.1%,71.5% Westem blot检测显示,实验组1#、2#、3中的TRIM37蛋白表达明显受到抑制,其沉默效率分别为82.1%,90.%,703%。与空白对系组和阴性对照组比较,具有明显差异(P<005)。选取沉默效率最高的第2组,进行下一步实验。2肿瘤的体积、重量和抑瘤率:空白对照组(con组)、阴性对照组(NC组)TRIM37 shRNA2#组动态观察至成瘤后35天,裸鼠皮下肿瘤的体积分别为82712±141.8mm3、992.58±1256mm3、2313±184.5mm3,肿瘤的质量分别为065010.12g、0.6860,11g、0.1740.08g。TRM37 shRNA2样组与空白对照组和阴性对照组比较,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.成功构建三组特异性靶向TRIM37基因的 shRNA慢病毒载体,根据靶向基因的mRNA和蛋白沉默效率,筛选出沉默效率最高的第2#组,为制备稳定转染的U87胶质瘤细胞株,以及视鼠体外实验提供可靠的实验基础。2实验证实,在体外环境下和向TRM37的 shRNA慢病毒转染的胶质瘤细胞增殖被抑制。第三部分:在UB7质霜胞中,激低TRM37蓄因表达抑制胶质瘪胞生长机制的研究目的：1.在第…部分实验的基础上,进一步研究U87股质瘤细胞中敲低TRIM37赫因表达,抑制胶质瘤细胞生长的机制。2敲低TRM37基因表达后,是否能够通过阻止U87胶质瘤细胞的EMT过程来抑制肿瘤细胞迁移和侵袭方法1细胞的培养、转染,同本课题第一部分,且同时进行2使用5uM浓度的SC79处理TRIM37 SiRNA L7股质瘤细胞,处理时间为24小时。3.蛋白免疫印迹分析,方法同实验第一部分4.CCK8检测细胞增殖, Transwell检测细胞迁移慢袭能力,方法同实验第一部分,且同时进行。结果1应用蛋白免疫印迹检测,敲低TRIM37基因表达的U87股质瘤细胞株中PBK和Akt的磷酸化水平,PBK磷酸化有所降低,而pAkt则显著降低,但总的PIK和Akt未见明显变化。应用P3K/AKT信号通路激活剂SC79处理后,可部分的逆转TRM37敲减的抑制作用。2R用免疫印迹技术检测相关蛋白表达变化, SiRNA转染U87胶质瘤细胞中Vimentin和 Ncadherin表达水平减低,而 E-cadherin表达水平增加。结论:1敲低TRM37表达可通过抑制P3KAKT信号通路的激活抑制胶质细胞的增殖和侵袭。2U87胶质瘤细胞中敲低TRM37表达,亦存在通过阻止胶质商细胞的上皮细胞间充质转化《EMT)过程来抑制肿瘤的迁移和侵袭。