第一部分:组蛋白H3K14M突变抑制嗜肺军团菌来源甲基转移酶活性目的:嗜肺军团菌编码表达具有组蛋白甲基转移酶活性的RomA,通过催化细胞中组蛋白的H3K14甲基化(H3K14me)干扰宿主细胞的表观遗传调控,利于自身的复制和增殖。近期研究发现组蛋白H3的K-to-M突变能够显著抑制对应的甲基转移酶的活性,因此本研究探讨真核宿主细胞中组蛋白H3上14位赖氨酸突变为甲硫氨酸(H3K14M)突变对嗜肺军团菌分泌的甲基转移酶RomA活性的影响及其内在机制。方法:构建组蛋白H3野生型(H3WT)以及H3K14M、H3K14I和H3K14R突变质粒,慢病毒包装并感染稳定过表达RomA的293T、THP-1等真核细胞。用Western blotting检测并比较带有不同H3K14突变的细胞中内源H3K14位点表观修饰的改变。并利用免疫共沉淀技术检测H3K14M与RomA蛋白的相互作用。结果:嗜肺军团菌的分泌效应物RomA通过靶向宿主细胞核,增加其H3K14甲基化水平同时降低H3K14乙酰化水平,从而抑制宿主基因的表达,促进嗜肺军团菌有效的细胞内复制;但组蛋白H3K14M突变可以通过增强与RomA蛋白的相互作用以抑制其甲基转移酶活性,阻断RomA对H3K14位点的甲基化。结论:组蛋白H3K14M突变显著抑制嗜肺军团菌来源甲基转移酶RomA活性。第二部分:通过靶向e IF4A有效抑制MYC扩增的髓母细胞瘤生长目的:髓母细胞瘤(Medulloblastoma,MB)是高发病率的恶性儿童脑肿瘤类型,其四个分子亚型WNT、SHH、第3型和第4型中以第3型预后最差,临床上缺乏靶向药物。癌基因MYC扩增或高表达是第3型MB的一大特征,并且MYC扩增预示着更差的预后。更重要的是,MYC已经被证明是第3型MB的有效药物靶标,所以我们希望找到能有效靶向MYC的治疗策略。方法:我们首先评估MYC基因RNA和蛋白质的稳定性,并尝试通过靶向MYC的转录或者翻译以达到杀伤MYC扩增髓母细胞瘤的目的。接着我们通过R2数据库分析找到在第3型MB中相对于正常脑组织和其他亚型MB高表达并且与MYC表达高度相关的翻译相关基因。我们通过CRISPR/Cas9技术或者相应抑制剂Silvestrol在体内体外验证靶向e IF4A1对MYC扩增髓母细胞瘤的杀伤效果。此外,我们通过Ed U细胞增殖试验、细胞凋亡试验、蛋白质免疫印迹及细胞活力检测探究靶向e IF4A1治疗肿瘤的分子机制。结果:我们发现MYC蛋白和RNA稳定性都很低,并且在第3型MB中e IF4A1与MYC的表达具有高度相关性,e IF4A1在第3型髓母细胞瘤中的表达显著高于其他亚型髓母细胞瘤及正常脑组织。我们在体内体外都证实了通过CRISPR/Cas9技术靶向e IF4A1的抗肿瘤效应。此外,e IF4A1抑制剂Silvestrol能够通过下调MYC蛋白抑制第3型髓母细胞瘤。在MYC低表达的细胞中过表达MYC可以提高细胞对Silvestrol的敏感性,与此相反,MYC高表达细胞中敲低MYC可以显著降低细胞对Silvestrol的敏感性。结论:我们的研究证明通过靶向e IF4A1抑制MYC蛋白的翻译可能是治疗MYC扩增髓母细胞瘤的有效策略。