研究背景:子宫颈癌是最常见的恶性肿瘤之一,发病率位于女性恶性肿瘤的第二位。全世界每年大约有20万妇女死于这种疾病。子宫颈癌的病因至今尚未完全明了,是多因素,多步骤发展的结果。高危型HPV的持续感染是导致宫颈癌发生的最危险的因素。当HPV感染宿主细胞后,通过整合宿主DNA能够编码早期癌蛋白E6。目前尚未发现E6蛋白具有酶活性,主要通过蛋白与蛋白的相互作用发挥致癌功能。研究发现,E6在宫颈癌的致病过程中,E6AP几乎介导了E6的全部功能。首先E6与E6AP结合形成E6/E6AP复合体,然后与p53结合,E6AP将活化的泛素转移至p53蛋白,p53则进入泛素化降解途径,最终在蛋白酶体26S的作用下被降解。所以,E6AP的泛素化降解p53的功能对子宫颈癌的发生发展起着关键性的作用。E6AP (E6-associated protien)基因又称为UBE3A(ubiquitin protein ligase E3A),位于染色体15q11–q13,是HECT E3 (E3 homology to the E6AP carboxy Terminus E3)蛋白家族成员。根据N端的不同,E6AP分为有三个转录本,Ⅰ型编码98.9 kDa;Ⅱ型编码101.7 kDa;Ⅲ编码101.1 kDa,三种亚型均具有蛋白降解的功能。E6AP的功能比较复杂,研究发现,在应激状态下,E6AP的表达水平显著升高,与分子伴侣Hsp70/Hsc70结合,能够抑制应激诱导的细胞凋亡。在子宫颈癌的发病过程中,E6AP最重要的作用就是能够降解抑癌蛋白p53。E6与E6AP结合形成E6/E6AP复合体,与p53结合,E6AP将活化的泛素转移至p53蛋白,引起p53的泛素化降解。E6AP在宫颈癌中的另外一个重要作用是上调端粒酶启动子hTERT的表达,该机制与p53的降解无关。E6首先与E6AP结合,激活了c-Myc启动子,促进c-Myc的转录,进一步激活hTERT的启动子,通过诱导hTERT启动子组蛋白H3的乙酰化,促进hTERT的表达并提高端粒酶的活性。这充分说明E6AP能够促进子宫颈癌的发生发展。GRIMs (genes associated with retinoid-IFN-inducedmortality)是最近发现的一群参与干扰素( interferon, IFN)和维甲酸(retinoic acid, RA)合并诱导的细胞凋亡基因。GRIM-19属GRIMs家族成员,是参与细胞线粒体的呼吸作用和调控细胞凋亡的新基因,定位于19 p13.2,该区的多种基因为前列腺癌的抑制基因。编码含144个氨基酸残基的蛋白质,分子量约16kD,表达于人体多种正常组织中,主要定位在线粒体,细胞核也有少量表达。GRIM-19的正常表达可以维持细胞正常生活周期,使细胞从衰老进入凋亡,低表达则使某些细胞不能正常地进入细胞凋亡周期,从而引发肿瘤的发生。如甲状腺肿瘤、肾癌、口腔癌、结直肠癌等中均发现GRIM-19表达的降低。STAT3在许多肿瘤中处于持续激活状态,是肿瘤治疗的新靶点。目前研究认为GRIM-19是STAT3表达和激活的负性调节子,GRIM-19与其结合后,抑制其激活引起的下游基因的转录,这一结合作用是在GRIM-19的丝氨酸727转激活位点完成的。研究还发现,子宫颈癌HPV的E6蛋白可以与GRI M-19直接结合,且高危型HPV的结合作用强于低危型HPV。但是,GRIM-19在子宫颈细胞癌变的具体作用机制目前尚不清楚。本课题组在前期研究中发现子宫颈癌组织中GRIM-19表达显著降低。同时通过体内实验发现,GRIM-19具有促进细胞凋亡的作用;进一步的研究还发现在HPV阳性的子宫颈癌细胞株HeLa、SiHa和CaSki细胞中均发现GRIM-19可以上调p53的表达,而HPV阴性的卵巢癌细胞株H08910细胞中却并未发现该现象,推论GRIM-19具有诱导子宫颈癌细胞株中p53蛋白积聚的重要作用,这种作用的发挥是依靠抑制p53蛋白的降解,延长其半衰期来实现的。而在子宫颈癌细胞中p53的降解主要是由于E6AP的泛素化降解作用。研究已经证实,GRIM-19能够和许多细胞因子和蛋白分子发生直接结合作用。所以,我们推测,GRIM-19可能与E6AP发生结合作用,从而抑制了E6AP泛素化降解p53的功能。本实验在前期实验的基础上,将进一步研究GRIM-19与E6AP是否具有蛋白结合作用。目的:探讨GRIM-19和E6AP是否具有蛋白结合作用,进一步阐述GRIM-19的抑癌机制及其在子宫颈癌发病中的作用,为临床治疗的应用提供理论和实验依据。方法:①RT-PCR方法明确E6AP三种转录本在正常子宫颈组织和子宫颈癌组织中的表达情况;②采用免疫共沉淀方法(CO-IP)检测GRIM-19与E6AP蛋白体内结合作用;③E6AP-Ⅲ各截断体原核表达质粒的构建:pET-22b(+)-his-E6AP-Ⅲ;④在大肠杆菌中诱导融合蛋白pET-22b(+)-his-E6AP-Ⅲ各截断体的表达结果:①RT-PCR结果显示E6AP在子宫颈癌组织中三种亚型均有表达,并且表达高于正常子宫颈组织,其中Ⅱ型表达水平很低,主要以Ⅰ型和Ⅲ型为主;②免疫共沉淀(CO-IP)方法检测结果显示在子宫颈癌细胞株Hela,Siha,卵巢癌细胞株H08910中GRIM-19与E6AP具有蛋白结合作用;③E6AP-Ⅲ各截断体原核表达质粒构建成功;④在大肠杆菌中融合蛋白pET-22b(+)-his-E6AP-Ⅲ各截断体诱导表达成功结论:GRIM-19与E6AP在体内水平具有蛋白结合作用,并且成功构建出E6AP-Ⅲ各截断体的原核表达质粒以及成功诱导表达了融合蛋白pET-22b(+)-his-E6AP-Ⅲ各截断体,为进一步在体外水平研究GRIM-19与E6AP是否具有直接结合以及作用的具体机制提供了实验基础。