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目的:研究川弯嗪体内外干预对血小板活化的影响,并从microRNA(miRNA)及其靶基因和相关信号转导通路调控探讨川芎嗪抑制血小板活化的作用机制,以期进一步从miRNA及相关通路调控丰富川芎嗪抗血小板活化作用机制,为其临床抗血小板治疗提供实验依据。方法:1、体外实验:血小板经不同浓度盐酸川芎嗪(Ligustrazine Hydrochloride,LH;1、2、3 mM)预处理后,给予二磷酸腺苷(Adenosine diphosphate,ADP;5.5 μM)刺激,通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,酶联免疫吸附试验(EnzymeLinked Immunosorbent Assay,ELISA)检测血栓素 B2(Thromboxane B2,TXB2)含量和Western-blot检测整合素αIIbβ3的表达及其磷酸化水平;体内实验:Sprague-Dawley(SD)大鼠经盐酸川号嗪预处理后(80mg/kg/d),通过皮下注射肾上腺素(Adrenaline;1mg/kg)构建血小板过度活化大鼠模型,采用剪尾法检测小鼠出血时间改变,并提取血小板和给予ADP刺激,采用比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量,ELISA检测血清中TXB2和6-酮-前列环素(6-keto-PGF1α)含量。2、采用Western-blot检测不同浓度盐酸川芎嗪(LH;1、2、3 mM)体外干预对ADP刺激后血小板中AKT、ERK、p38MAPK的表达及其磷酸化水平和80 mg/kg/d的川芎嗪体内干预对AKT表达及磷酸化水平的影响;采用AKT通路激活剂胰岛素样生长因子-1(Insulin-like Growth Factor 1,IGF-1;300 mM)诱导血小板,并通过比浊法检测血小板聚集,流式细胞仪检测血小板内Ca2+含量和ELISA检测血清中TXB2含量。3、采用miRNATLDA芯片检测川芎嗪干预对SD大鼠血小板中miRNA表达的影响,通过靶基因预测和通路(Pathway)分析川芎嗪干预后被显著富集的差异表达miRNA相关信号转导通路,并通过Western-blot检测AKT通路反向调节因子PTEN、THEM4和PHLPP等基因在蛋白水平的表达。结果:1、体外实验:川芎嗪体外干预显著抑制ADP诱导的血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量,降低血小板中整合素αIIbβ3的磷酸化水平;体内实验:川芎嗪预处理显著延长血小板过度活化SD模型大鼠出血时间,降低血小板Ca2+含量和血清中TXB2的含量,增加血清中6-keto-PGF1α含量。2、川号嗪干预显著抑制ADP诱导后血小板AKT、ERK和p38MAPK的磷酸化水平;川芎嗪干预显著降低AKT通路激活剂(IGF-1)诱导后的血小板AKT的磷酸化水平,显著抑制血小板聚集,降低血小板中Ca2+含量和血小板上清液中TXB2的含量。3、川芎嗪预处理显著下调血小板过度活化模型大鼠血小板中39个miRNA的表达,靶基因预测和Pathway分析证实PI3K/AKT通路被显著富集,川号嗪干预显著下调血小板miR-331-3p、miR-34a-5p及上调二者的共同靶基因、AKT反向调节因子PHLPP的表达。结论:川弯嗪体内外干预显著抑制血小板聚集,且通过下调miR-331-3p、miR-34a-5p等miRNA和上调PHLPP等靶基因表达,进而抑制PI3K/AKT等相关信号转导通路可能是其发挥抑制血小板活化的重要机制。