转录因子(Transcription Factors,TFs)是重要的反式作用因子,与生命活动的调控息息相关,在植物的次生代谢产物合成过程中亦是如此。植物TFs中以MYB家族最常见,研究最深入,其中R2R3-MYB类TFs占MYB研究主导地位,植物的各类生命活动中都有这类转录因子参与调控。本研究就曼地亚红豆杉茎段中不同组织部位所表现出代谢谱和蛋白谱差异,尤其是针对对紫杉烷类化合物的组织差异积累及紫杉醇生物合成途径相关酶的组织表达差异做了详细研究。为了区分曼地亚红豆杉茎段的不同组织,我们对茎段进行了石蜡切片,将茎段区分为表皮(Cortex)、韧皮(Phloem)、木质部(Xylem)和髓部(Pith)四个组织部位。后据此分析了这四个不同茎段组织部位在代谢谱和蛋白谱上的差异。主成分分析(PCA)表明表皮与韧皮之间差异性最小,而木质部和木髓之间差异较大。具体结果表明,各类代谢物积累和蛋白表达水平在不同茎段组织中具有较大差异。其中,紫杉醇合成途径中涉及的诸多前体物、中间产物、最终产物及相应的催化酶蛋白亦具有显著的组织差异性。研究结果表明,紫杉醇合成途径中末端中间产物和终产物大量积累于韧皮部中。此外,有部分紫杉醇合成前体物和催化酶在髓部中具最高的积累量和表达水平。表皮虽然组织量少缺乏,干枯疏松,但总体代谢物含量仅次于韧皮部,紫杉醇合成途径中的众多中间产物在表皮的含量也仅次于韧皮部。木质部代谢物含量是四个组织部位中最低的,紫杉醇合成相关代谢物含量也是最低的。依据组学数据,我们从曼地亚红豆杉中克隆出韧皮部特异表达蛋白Tm MYB3,通过生物信息学鉴定Tm MYB3并初步分析了其生物学功能,包括:亚细胞定位、蛋白序列比对、同源进化分析、蛋白原核表达等。进一步通过染色体步移技术,我们克隆了一系列紫杉醇合成途径关键基因的启动子序列,其中三个基因(TS、TBT和DBTNBT)的启动子具有经典的MYB结合元件元件。通过电泳迁移率实验(EMSA),验证了Tm MYB3能直接结合于上述三个基因的启动子上。后进一步通过双荧光表达系统分析Tm MYB3是否具有调控上述三个关键基因的功能。结果显示,Tm MYB3能结合并调控TS和TBT启动子下游荧光基因的表达,但不能调控DBTNBT启动子下游荧光基因的表达,这说明TS和TBT是Tm MYB3的下游靶基因。紫杉醇合成相关代谢物的积累具有明显的茎段组织差异,我们分析了它们在茎段不同组织之间可能存在的移动。分析发现,MEP途径提供的紫杉醇合成重要前体物GGDPS可能在韧皮部中合成,随即转运至木髓中;TS的下游产物taxa-4(5),11(12)-diene可能在韧皮部合成,转运至木质部中;而TBT作用的上游前体物10-deacetyl-2-debenzoylbaccatin III在韧皮部中合成,继而转运至表皮和木髓中。综上所述,我们通过代谢组与蛋白组整合分析的手段,得到了曼地亚红豆杉茎段不同组织的代谢物积累谱和蛋白质表达谱,这为揭示紫杉烷类化合物茎段组织差异积累提供了基础数据。紫杉烷类化合物差异积累说明,曼地亚红豆杉茎段不同组织材料都具有潜在的生物工程应用价值。我们筛选得到的韧皮部特异性表达转录因子——Tm MYB3,能够促进TS和TBT启动子下游靶基因的表达,它们可能在曼地亚红豆杉紫杉醇合成途径的调控中扮演着重要的角色。