论文部分内容阅读
中枢神经系统损伤常常导致损伤部位神经元及胶质细胞的丧失。存在于成年中枢神经系统特定区域的神经干细胞通常会响应损伤而被迅速激活。然而,成体神经干细胞激活迁移到损伤区后却大量分化为胶质细胞,在损伤微环境作用下一般不能产生足够的神经元。这也是成年个体脊髓损伤后很难自发再生,最终导致永久性神经功能障碍的原因之一。因此,通过改善损伤微环境促进内源神经干细胞更多地向神经元分化,以补充损伤丢失的神经元,是脊髓损伤修复面临的重大任务。本论文的研究主要围绕影响脊髓损伤后神经再生的不同因素,设计并构建利于神经再生的有效体系,而这需要通过生物材料与神经再生抑制因子拮抗蛋白等不同因素的有机整合来实现,然后应用不同因子修饰的功能支架移植来桥接损伤的脊髓,改善损伤区神经再生微环境,促进神经元的发生及进一步成熟并最终实现受损脊髓的功能恢复。研究结果如下: 1.EGFR抗体和微管稳定分子共同修饰的复合功能支架的构建及治疗评价。已经证明EGFR抗体(Cetuximab)可以封闭神经再生抑制信号促进神经元分化,微管稳定分子(Taxol)可以通过调节微管稳定降低瘢痕形成、促进神经再生。基于以上两点,以线性有序胶原支架为载体,构建了Cetuximab和Taxol共同修饰的复合功能支架,使其能有效拮抗相关抑制分子对神经再生的抑制作用,同时还可以稳定微管的结构。分别将单因子(5μg Cetuximab或256 ng Taxol)和双因子(5μg Cetuximab和256 ng Taxol)修饰的功能支架移植到大鼠脊髓全横断损伤模型中以评价复合治疗是否具有协同效应。结果发现:复合功能支架促进了脊髓损伤部位更多的神经发生,抑制了瘢痕相关成分的沉积,最终实现了脊髓损伤大鼠更好的行为功能恢复。 2.胶原特异结合的EGFR抗体修饰的功能支架的构建及治疗评价。为了实现EGFR抗体胶原材料上的缓慢释放,且较小分子量的Fab片段具有体内循环周期短,免疫原性低的优势,实验室前期选择性表达了Cetuximab的功能片段Fab并在其氨基端融合一段胶原结合区(Collagen Binding Domain,CBD),我们称之为CBD-Fab。之后,我们构建了结合有上述重组蛋白CBD-Fab的功能胶原支架。体外实验表明,CBD-Fab能与胶原支架特异结合并实现缓慢释放,还能中和抑制因子(Nogo-A,MAG,OMgp,CSPG)的抑制作用促进神经突生长及神经干细胞向神经元分化。体内实验表明,CBD-Fab修饰的功能支架促进了大鼠脊髓损伤区更多的内源神经干细胞来源的神经发生。这些神经干细胞不仅可以分化为神经元,还可以进一步成熟为功能神经元以重新连接受损的间隙。此外,这些大鼠在术后三个月的修复期内还表现出更有效的行为学恢复。 3.胶原特异结合的EGFR抗体剂量对神经再生的影响。基于用药过程中剂量选择的关键性,即过低剂量达不到理想药效,而过高剂量又会引起副作用,我们探索了CBD-Fab剂量对神经再生的影响,发现CBD-Fab以一种剂量依赖的方式促进神经再生,即适当剂量的CBD-Fab可以更好地诱导神经再生。 总之,我们构建的功能支架体系可以通过改善脊髓损伤区神经再生抑制性微环境,来诱导内源性神经元发生和进一步成熟,并使其再生跨越损伤断端重建功能突触联系,最终可以促进损伤动物的功能恢复,具有较好的临床应用前景。